江苏地区奶牛源葡萄球菌耐药性分析与红霉素诱导的克林霉素耐药检测

王 强，黄 攀，王倩倩，陈培华，马 莉，房 丹，金文杰，秦爱建

（1.扬州大学兽医学院 江苏省动物预防医学重点实验室 教育部禽类预防医学重点实验室 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225001；2.扬州市畜牧兽医站，扬州 225001；3.宝应县畜牧兽医站，扬州225800）

葡萄球菌是引起奶牛乳房炎常见菌株，同时也是重要的人畜共患病原微生物[1]。红霉素常用于葡萄球菌引起的感染的治疗，红霉素对于克林霉素具有诱导耐药的作用，可导致克林霉素的临床治疗失败。而传统药物敏感实验并不能检测出红霉素诱导克林霉素耐药情况，故而对于临床红霉素耐药而克林霉素敏感或中介的菌株需要额外做D环实验进行检测[2]。葡萄球菌对大环内酯类抗生素（如红霉素）的主要耐药机制为核糖体靶位点的修饰或外排泵机制[3]。外排泵机制由msrA基因编码膜蛋白调节[4]，介导大环内脂类、链阳霉素B耐药[5]靶位修饰机制由ermA、ermC等基因调节，编码23S rRNA甲基化，减少核糖体与MLSB（macrolides，lincosamides，and type B streptogramins）药物的结合，导致MLSB耐药。MLSB耐药是由于诱导大环内酯上游序列弱化子结合，导致mRNA二级结构的改变，暴露核糖体结合位点翻译erm甲基化酶。固有型MLSB耐药（constitutive，cMLSB）[6]是由于5'上游序列发生缺失、重复及突变，导致甲基化酶固有型表达，诱导型MLSB（inducible MLSB，iMLSB）耐药[7]表现为对14、15元大环内酯（如红霉素）耐药，而对16元大环内酯、林克酰胺类及B型链阳霉素敏感。为了解本地区流行的细菌的耐药现状及指导临床用药，本研究对已分离的218株葡萄球菌进行耐药分析。

1 材料与方法

1.1 病料采集 江苏扬州、沭阳、如皋等奶牛场乳房炎送检牛奶样品，使用移液器无菌吸取100μL，使用灭菌棉棒均匀涂布于绵羊血平板上，37℃培养过夜。

1.2 病原菌的鉴定 挑取平板的单菌落，再次划线接种于绵羊血平板进行纯化，37℃培养过夜。纯化后的细菌平板挑取单菌落进行革兰氏染色，油镜观察后，选择革兰氏阳性球菌的细菌进行下一步鉴定。使用以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）方法[8]鉴定菌种，简称MBT法。MBT法的原理在于使用甲酸裂解细菌的细胞壁后，基质与菌体核糖体蛋白形成结晶后快速蒸发带入气相，且带上正电荷后，激光高频轰击核糖体蛋白形成蛋白信号被捕获后与文库进行比对，鉴定菌种。其中MBT法所使用的标准品BTS、基质均由布鲁克公司生产。挑取少量单菌落的细菌，均匀涂布于MALDI靶板孔上，加1 μL甲酸裂解细胞壁，自然干燥后再加1 μL基质，自然干燥后将靶板放入MALDI-TF质谱仪鉴定。

1.3 药敏实验与红霉素诱导克林霉素耐药实验（D环实验） 参考CLSI 2017标准，挑选表1抗生素药敏纸片进行药敏实验。药敏纸片购于杭州微生物试剂公司。

表1 药敏纸片信息表Table1 The information of K-B papers

药敏实验使用K-B纸片法。D环实验挑取红霉素耐药且克林霉素中介或者敏感的金黄色葡萄球菌的单菌落配置于0.5麦氏浊度的菌液，吸取100 μL均匀涂布于MH平板上，按照CLSI 2017版标准进行操作与判读。若克林霉素靠近红霉素抑菌圈出现截平反应时，则判读D环实验阳性，若抑菌圈无明显形状变化，则判读D环实验阴性。

1.4 耐药基因检测 主要检测葡萄球菌中msrA、ermA、ermC三类基因。PCR引物序列与条件参考文献[9]。PCR：使用购置于天根公司的细菌DNA试剂盒提取DNA，引物由华大基因合成。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性20s，55℃退火20s，70℃延伸45 s，35个循环。

2 结果

2.1 葡萄球菌菌种鉴定结果 使用MBT法对分离菌种进行鉴定，结果可知，218份临床分离葡萄球菌株中，金黄色葡萄球菌为58株、溶血性葡萄球菌13株、松鼠葡萄球菌36株、马胃葡萄球菌11株、木糖葡萄球菌20株、表皮葡萄球菌20株。此外，还有苍蝇葡萄球菌、琥珀葡萄球菌、腐生葡萄球菌等其他葡萄球菌共计60株，见图1。

图1 各类葡萄球菌分离图Fig.1 Diagram of staphylococcus isolates

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

2.2 葡萄球菌多重耐药统计 通过对药敏数据分析，得出细菌耐药数据（图2）。挑选13类抗生素共20种，分别为大环内酯类：红霉素、克拉霉素；喹诺酮类：诺氟沙星、左氟沙星、环丙沙星；四环素类：米洛环素、四环素；林可霉素类：克林霉素；氯霉素类：氯霉素；多磷类：磷霉素；多肽类：多粘菌素B、替考拉宁；青霉素类：青霉素；头孢菌素类：头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶；头霉素类：头孢西丁；磺胺类：复方新诺明；氨基糖苷类：大观霉素；硝基呋喃类：呋喃妥因。以菌株对同一类抗生素耐药情况统计，三重耐药以上为多重耐药，结果显示，有74株葡萄球菌分离株呈现多重耐药，见表3。

表3 218株葡萄球菌分离株对20种抗生素的药敏结果Table 3 Susceptibility of 218 strains of Staphylococcus isolates to 20 antibiotics

图2 耐药统计表Fig.2 Drug resistance statistics

2.3 红霉素诱导克林霉素耐药实验（D环实验） 临床奶样分离得到葡萄球菌218株，其中金黄色葡萄球菌（SA）58株，凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）160株。K-B法药敏试验显示，分离菌株均对头孢西丁敏感，红霉素耐药率为10.7%（31/218），其中金黄色葡萄球菌1株、凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）30株。3株凝固酶阴性葡萄球菌（1株为头葡萄球菌、2株为木糖葡萄球菌）表现为固有型MLSB耐药，对红霉素和克林霉素均耐药。有21株葡萄球菌表现红霉素耐药而克林霉素敏感或中介。有6株葡萄球菌D环实验呈现阳性。

图3 D环实验结果Fig.3 D-test results

2.4 耐药基因检测结果 对上述6株葡萄球菌进行耐药基因PCR检测，结果显示，以这6株葡萄球菌为模板均扩增到了大小为420 bp的条带，与ermA基因大小一致，但未扩增到与ermC基因大小（520 bp）一致的条带，表明这些菌株均携带ermA基因而不携带ermC基因。

图4 ermA基因PCR结果Fig.4 PCR results of ermA gene

3 讨论

本研究分离所得的218株葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌占比26.61%，凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）占比高达73.39%，显示凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）导致的奶牛隐性乳房炎在奶牛群中发病更为严重，与北京报道的病例[10]接近。对218株葡萄球菌耐药性分析显示，青霉素耐药菌株达179株，占比超过82%，揭示了临床抗生素的滥用使得耐药性菌株数量大大增加。其中，临床常用药物如复方新诺明耐药率达19%，诺氟沙星耐药率27%，环丙沙星耐药率26%，头孢他啶耐药率达45%。多重耐药主要表现在二重耐药至四重耐药之间，偶见超过七重耐药的葡萄球菌，多种耐药率为33.9%。与青海地区[11]对比，江苏地区葡萄球菌菌株耐药率低于青海地区菌株，头孢噻肟的耐药率也低于青海病例。与新疆地区[12]对比，新疆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对头孢西丁，耐药率高达100%，而江苏地区细菌分离株对头孢西丁均表现为敏感，两地差异较大，显示了携带不同的耐药元件。杜琳等[13]分析上海金黄色葡萄球菌分离株对头孢西丁的耐药率高达83.33%，与江苏地区有较大差异。临床常使用红霉素软膏进行奶牛乳头保养，如同时使用克林霉素则有可能导致克林霉素耐药，临床使用这两类药物需要注意。同时应根据药敏结果，注重青霉素的滥用的情况，及时参考药敏实验结果更换其他抗生素，推荐多种抗生素足量混合使用，以减少耐药菌株的产生。近几年，由于减抗养殖的推广，鱼腥草[14]、板蓝根、蒲地蓝等传统中药使用率提高，同时一些抑菌多肽[15]的应用也减少了抗生素的使用，以上方法均可有效降低细菌耐药性的增加。