河北省部分地区羊肠道病毒的流行病学调查与分析

鲁桂侠

（滦平县农业农村局，滦平068250）

肠道病毒（Enterovirus，EV）属于微RNA病毒科肠道病毒属，对牛、羊、猪及人类均易感[1]，羊感染羊肠道病毒（Caprine enterovirus，CEV）后可引起以严重腹泻、高热、流涎为主要特征的消化系统和呼吸系统系列症状疫病[2-3]。CEV最早于2012年由Boros等[4]在匈牙利某发生严重腹泻的绵羊体内发现，王明月等[5]于2014年在吉林省某羊场发生严重腹泻、发热、流涎、口腔黏膜溃疡为特征的患病山羊体内分离鉴定出我国第1株CEV，同时完成了该分离毒株的基因组测序工作[6]，目前CEV已在我国养羊密集地区广泛流行[7]。近年来，随着河北省肉羊养殖规模的逐步扩大，羊病毒性腹泻的发生率也随之增加，给河北省肉羊养殖生产造成了巨大的经济损失，也在一定程度上阻碍了河北省肉羊养殖产业的健康发展。为了掌握河北省部分地区CEV的感染现状，有效保护河北省肉羊养殖产业的健康发展，本研究采用RT-PCR方法对2017-2019年采集于河北省不同地区的266份腹泻羊的粪便样品进行了CEV感染的病原学检测，并对检测结果进行了不同地区、不同年份、不同季节、不同饲养阶段、不同饲养方式的阳性感染率的分析比较，这是国内首次针对河北省进行的CEV流行病学调查与分析，结果确定了河北省CEV的感染现状和流行病学特点，丰富了我国CEV感染的流行病学资料，为我国CEV综合防控措施的制定提供了指导依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒、一步法RT-PCR扩增试剂盒、pMD18-T载体购自日本TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 样品来源及处理方法 于2017年1月-2019年12月采集临床中具有明显腹泻症状的266份腹泻羊的新鲜粪便样品，其中在石家庄市采集腹泻样本28份，在保定市采集腹泻样本34份，在秦皇岛市采集腹泻样本32份，在承德市采集腹泻样本70份，在沧州市采集腹泻样本56份，在廊坊市采集腹泻样本46份。将采集的新鲜粪便样品溶解于5倍体积的灭菌生理盐水中，充分碾磨、混合均匀后，以12 000 ×g离心10 min，吸取的上清液即为处理后的待检测粪便样品，置-20℃保存备用。

1.3 核酸提取 利用病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒依次提取266份临床腹泻样本、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、绵羊痘病毒（Sheep pox virus，SPV）的核酸。

1.4 引物设计与合成 根据CEV序列（GenBank登录号：KU297674.1）5'UTR保守区设计1对特异性检测引物（F：5'-GCAAGGATCGTTACC-3'、R：5'-GTTACGACGTAGCAAC-3'），预期扩增片段约为300 bp，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

1.5 RT-PCR扩增 一步法RT-PCR扩增体系为：2×One Step Buffer 12.5 µL，One Step Enzyme Mix 0.5 µL，上、下游引物各0.5 µL，核酸3.0 µL，ddH2O 8.0 µL。一步法RT-PCR扩增程序为：50℃ 30 min；95℃预变性5 min；95℃变性30 s，53℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃再延伸10 min。利用CEV检测引物依次对提取的CEV、BVDV、PRV、GPV、SPV核酸进行一步法RT-PCR扩增，确定RT-PCR扩增的特异性。利用ddH2O依次对CEV核酸进行10倍倍比稀释，利用CEV检测引物依次对不同稀释度的CEV核酸进行一步法RT-PCR扩增，确定其敏感性。利用CEV检测引物依次对提取的133份粪便样品核酸进行一步法RT-PCR扩增，确定临床腹泻样本的检出率。

1.6 CEV流行特点的比较分析 根据不同地区、不同年份、不同季节、不同饲养阶段、不同饲养方式等条件对266份腹泻样本的RT-PCR扩增结果进行比较分析，确定河北省CEV的流行病学特点。

2 结果与讨论

2.1 RT-PCR方法的特异性和敏感性结果 利用CEV检测引物依次对提取的CEV、BVDV、PRV、GPV、SPV核酸进行一步法RT-PCR扩增，结果只有CEV扩增出约300 bp的特异性条带，与预期相符，而BVDV、PRV、GPV、SPV扩增结果均为阴性，RT-PCR方法具有良好的特异性。利用CEV检测引物依次对不同稀释度的CEV核酸进行一步法RT-PCR扩增，结果表明可以检测到10-4稀释的RNA模板，具有良好的敏感性。以上结果说明该RTPCR方法完全可以应用于临床中CEV感染的快速诊断和流行病学监测。

图1 RT-PCR方法的特异性Fig.1 Specificity of RT-PCR

图2 RT-PCR方法的敏感性Fig.2 Sensitivity of RT-PCR

2.2 临床样本的RT-PCR扩增结果 自2016年王明月等[5]报道我国发现首株CEV后，我国研究学者高度重视国内CEV的流行情况，陆续进行了不同地区CEV感染的流行病学监测。王汝都等[8]采用双抗体夹心ELISA方法对2015-2018年采集于河南省的1074份羊肠道或粪便样品进行CEV感染的病原学检测，其平均阳性感染率为19.93%。李欣等[9]采用夹心ELISA方法对山东省内的182份绵羊和山羊粪便样品进行了CEV感染的流行病学检测，绵羊和山羊CEV阳性感染率分别为58.67%和48.60%，山东省内CEV平均阳性感染率为52.75%。鲁海冰等[10]采用夹心ELISA方法对吉林和内蒙古不同羊场的432份羊粪便样品进行了CEV感染的病原学检测，吉林和内蒙古不同市区羊群CEV阳性感染率介于11.40%～100.0%，CEV平均阳性感染率为49.77%。张群等[11]采用夹心ELISA方法分别对吉林省208份羊粪便样品和内蒙古地区959份羊粪便样品进行了CEV感染的病原学检测，吉林省和内蒙古CEV平均阳性感染率分别为83.17%和59.12%。本研究采用RT-PCR方法对2017-2019年采集于河北省部分地区的266份羊粪便样品进行了CEV感染的病原学检测，共检测出CEV阳性样品74份（部分样品的RT-PCR扩增结果见图3），CEV阳性感染率达27.82%。以上流行病学监测结果表明，我国羊群中CEV阳性感染率在不同地区各有不同，且在部分地区CEV阳性感染率较高，个别地区CEV感染情况较严重，加强CEV的综合防控措施已迫在眉睫。本研究中河北省CEV平均阳性感染率显著低于李欣[9]、鲁海冰[10]、张群等[11]流行病学调查的CEV阳性感染率，表明相对于国内其他地区，河北省CEV阳性流行情况尚处于较低的发病水平，只要加强综合防控措施可以有效控制该疾病的发生与传播。

图3 部分样品RT-PCR扩增结果Fig.3 RT-PCR results of some samples

2.3 CEV流行特点的比较分析结果 CEV作为一种新发传染病，其流行特点尚不明确。为了全面掌握CEV的流行特点，本研究将266份粪便样品的CEV病原学检测结果进行了不同地区、不同年份、不同季节、不同饲养阶段、不同饲养方式等条件进行比较分析。通过对不同地区样品的检测结果进行统计分析（表1）可知，河北省不同地区均存在不同程度的CEV感染，其中以承德市的感染率最高（37.14%），沧州市次之（35.71%），石家庄市感染率较低（14.29%）。通过对不同年份的检测结果进行统计分析（表2）可知，2017-2019年CEV阳性感染率分别为21.62%、26.67%、33.33%，2018年较2017年增长了5.05%，2019年较2017年、2018年分别增长了11.71%、6.66%，表明CEV在河北省的感染存在逐年严重的趋势。通过对不同季节的检测结果进行统计分析（表3）可知，不同季节对CEV阳性感染率的影响较大，秋季CEV阳性感染率最高（34.09%），春季次之（32.43%），夏季和冬季的CEV阳性感染率相对较低，分别为14.29%和22.58%。通过对羊不同饲养阶段的检测结果进行统计分析（表4）可知，不同饲养阶段对CEV阳性感染率的影响较大，羔羊CEV阳性感染率最高（37.29%），育肥羊和后备种羊的阳性感染率相对较低，分别为14.26%和15.79%。通过对羊不同饲养方式的检测结果进行统计分析（表5）可知，不同饲养方式对CEV阳性感染率的影响较大，圈养方式下CEV阳性感染率最高（35.94%），散养方式下CEV阳性感染率最低（15.38%）。以上流行特点统计分析表明，不同地区羊群中均存在不同程度的CEV感染，个别地区感染情况较严重；不同年份羊群中CEV阳性感染率差异较大，CEV的感染存在逐年严重的趋势；不同季节对CEV阳性感染率的影响较大，秋季和春季相对于夏季和冬季更容易感染CEV；不同饲养阶段对CEV阳性感染率的影响较大，羔羊相对于育肥羊和后备种羊更容易感染CEV；不同饲养方式对CEV阳性感染率的影响较大，圈养方式相对于散养方式更容易感染CEV。通过对不同地区、不同年份、不同季节、不同饲养阶段、不同饲养方式的比较分析，掌握了河北省CEV的流行特点，丰富了河北省CEV流行病学资料，为河北省乃至全国CEV综合防控措施的制定提供了理论支持。

表1 不同地区的检测结果Table 1 The results of di ff erent regions

表2 不同年份的检测结果Table 2 The results of di ff erent years

表3 不同季节的检测结果Table 3 The results of di ff erent seasons

表4 不同饲养阶段的检测结果Table 4 The results of di ff erent feeding stages

表5 不同饲养方式的检测结果Table 5 The results of di ff erent feeding methods