微生物降解木质素的研究进展

杨 静，蒋剑春，张 宁，徐 浩，解静聪，赵 剑

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042; 2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037; 3.淮阴工学院 江苏省生物质转化与过程集成工程实验室，江苏 淮安 223003)

木质纤维原料是地球上最丰富、最廉价易得的可再生能源之一。木质纤维原料主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，其中半纤维素通过共价键和氢键与木质素分子紧密相连，使得天然木质纤维结构非常牢固，对酶促及微生物水解等作用具有很强的抗逆性，木质素降解成为自然界碳循环的限速步骤[1]。在生物质生物精炼过程中，木质素与其他组分紧密结合，干扰了木质纤维原料的预处理过程，木质素的降解产物会进一步抑制后续发酵过程，同时也会吸附水解酶[2]，成为生物质高效利用的一大挑战。与化石燃料相比，源自生物质的生物燃料成本更高，因此基于生物质的生物精炼面临的主要挑战是其经济效益。如果能将包括木质素在内的所有生物质高效利用，那么就能大大提高生物质能生物精炼的经济效益。自然界中木质素的年产量为5～36亿吨[3]。制浆和造纸业是工业木质素的一个主要来源，每年能产生4 000～5 000万吨木质素[4]，主要以黑液形式存在，其中大部分以燃烧形式回收热能，仅有约1.5%被转化成高附加值的木质素磺酸盐或硫酸盐木质素等工业产品[5]，目前，黑液处理仍是造纸业发展的环保难题。由此可见，木质素的高效资源化利用可以显著提高木质纤维素生物炼制的经济可行性，同时有利于环境的可持续发展[6]。从20世纪80年代起，国内外对木质素的高效降解研究表明，木质素可通过物理、化学、物理-化学等方法降解，但大多数方法都需要严苛的操作条件、高耗能、高成本，以及存在降解过程中会产生抑制物影响后续的酶解、发酵过程等问题。生物预处理因具有低能耗、无化学药品添加以及对环境友好的优势被认为是一种极具潜力的生物质预处理方法[7]。作者综述了近年来降解木质素的微生物以及木质素降解酶的最新进展，并介绍了木质素生物降解炼制工业化产品的研究现状，以期为木质素的高效利用提供理论基础。

1 木质素化学结构

木质素是一种复杂的、无定型、三维长链高分子化合物，由苯丙烷单体聚合而成。由于甲氧基数量不同可将这些单体分为松柏醇(G型)、芥子醇(S型)和对香豆醇(H型)。不同生物质原料的木质素组成单元也不同，软木木质素含有较高G单元(80%～90%)，而硬木木质素含有25%～50%的G单元和50%～70%的S单元，草本木质素则含有这3种芳香单元的混合物(G型25%～50%，H型10%～25%，S型25%～50%)[8]。草本植物含木质素量最低(10%～19%)，软木和硬木的木质素量较高，含木质素分别为25%～35%和18%～25%[9]。

木质素各单元的直接连接键包括碳碳键和醚键，其中50%～80%为醚键，代表键型有β-O- 4、α-O- 4 和4-O-5；20%～35%为碳碳键，代表键型为β-5、β-1和5-5等[10]。木质素的反应活性受酚羟基、羰基、非环苄醚、甲氧基和脂肪族羟基等不同官能团的影响[11]。识别各种木质素的结构组成以及天然连接键对于木质素高效转化可再生燃料、材料或化学品非常重要。

2 降解木质素的微生物

2.1 真 菌

木质素是一种多酚、难降解有机聚合物，具有交联的复杂结构，无法像纤维素和半纤维素一样通过降解酶直接降解。尽管如此，有些微生物仍能通过氧化酶反应形成自由基和氧化还原介质，作用于木质素。能够降解木质素的微生物主要包括真菌和细菌。同时，真菌是一种主要的木质素降解微生物。目前对真菌中的白腐菌和褐腐菌降解木质素的研究最为广泛和深入，并已应用到酚类化合物的生物修复、生物制浆以及木质素产物精炼等领域[12]。在降解酶系组成及调控、降解酶基因工程以及降解机理等方面取得了一定的进展。白腐菌的木质素降解能力远远优于褐腐菌[13]。褐腐菌首先攻击纤维素，而白腐菌则通过各种酶攻击木质素和纤维素[14]。白腐菌对木质素的降解有选择性和非选择性两种途径。在选择途径中，白腐菌优先降解木质素，保留底物中较多的碳水化合物，而留下大部分纤维素，但非选择性途径则同时水解多糖和木质素[15]。黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉侧菌(Phlebiaradiata)、污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)等白腐菌均具有较强的木质素降解活性。褐腐菌只能部分降解木质素，使木质素芳香环结构保持不变，碳水化合物被去除，留下深褐色的木质素残留，但是木质素会通过芳香环的去甲基化或引入新的羰基和羧基而被氧化[16]。

2.2 细菌

虽然目前对真菌降解木质素的研究最为广泛和深入，但是真菌降解木质素存在预处理周期长、对环境适应性差，以及易于被孢子污染等问题[17]，仍需要探索更好的生物降解木质素途径。由于细菌具有极强的环境适应性及生物多样性，关于细菌降解木质素的研究也逐渐受到关注。近些年的研究证实细菌也能够分泌木质素降解酶，也是自然界木质素降解过程的重要参与者[18-19]。与真菌相比，细菌繁殖迅速、环境适应能力强、易于工业化应用；基因组较小，基因操作和关键酶的大规模重组表达更容易进行。研究表明，细菌可通过多种途径降解芳香物质，如单酚类、复杂的木质素及相关衍生物质[20]，在高湿度和低氧含量条件下，能够降解硬木和软木[21]，有望成为木质素大规模转化和利用的突破口。随着高通量测序技术的发展，国内外学者从白蚁肠道、牛胃、土壤和堆肥等材料中分离出多种具有木质素降解能力的细菌(表1)。

表1 可降解木质素的细菌

相比真菌降解木质素，细菌的另一个优势是能够适应低氧环境，这对某些工业应用领域来说意义重大[10]。 目前关于木质素厌氧降解的研究还比较少，但仍有一些研究证实某些厌氧菌能够降解木质素衍生甲氧基单芳香族化合物(香草酸和丁香酸)生成甲烷和二氧化碳[28]。脱硫微菌(Desulfomicrobiumsp.)是一种严格厌氧细菌，能够利用硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐作为自身电子受体参与木质素的降解[28]。研究人员从热带森林土壤中分离到了兼性厌氧菌甲苯单胞菌属(Tolumonaslignolytica)[29]和克雷伯氏菌(Klebsiellasp. )[30]，能够利用木质素作为碳源和能源生长。此外，食气梭菌(Clostridiummethoxybenzovorans)[31]、甲烷食甲基菌(Methanomethylovorans)[32]、肠杆菌(EnterobacterlignolyticusSCF1)[33]、红球菌(Rhodococcusjostii)[34]等均证实具有厌氧降解木质素的潜力。Xu等[35]研究发现枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在微氧条件下能够分泌过氧化物酶，经过24 h微氧发酵，玉米秸秆木质素降解率可达23%，证实该菌在微氧条件下可快速高效降解木质素。当枯草芽孢杆菌漆酶(CotA)基因在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达时，微氧环境有利于细胞积累合成漆酶所需的铜；而当供氧充足时，细胞无法获得足够的铜离子，导致无法合成完整漆酶[36]。天然木质素在厌氧条件下的降解速率缓慢，但是，高度甲氧基化木质素和可溶性木质素的降解相对容易[37]。关于厌氧降解木质素的机理还不清楚，但研究人员发现甲氧基芳烃(丁香酚)的厌氧降解分为3个步骤：1) 甲氧基化的芳香分子发生去甲基化，在此过程中，甲氧基化的芳香分子中的甲基被重新移动；2) 去甲氧基化芳香结构被打开并转化为乙酸、氢和二氧化碳；3) 进一步转化为甲烷和二氧化碳[38]。为了提高木质素的工业利用，厌氧微生物降解木质素将更具竞争力，并可在生物燃料、废水处理等领域发挥作用。

3 降解木质素的酶及其降解机制

木质素的三维复杂结构不能被低氧化/还原电位的氧化还原酶降解。通常，木质素需要通过解聚转换成可被微生物利用的小分子单元，这些小分子单元被微生物通过各种酶代谢成中间代谢产物，随后转化成聚羟基烷酸酯、聚乳酸等生物聚合物[39]。而木质素分解菌可产生细胞外氧化酶，这些酶通过形成高度活跃的自由基，通过氧化反应降解木质素。这些自由基通常具有很高的氧化/还原电位，并能进一步打开芳香环。除了芳香环裂解外，自由基还能进一步使芳香环脱甲氧基化[40]。

3.1 过氧化物酶

一般来说，真菌和细菌的木质素降解活性依赖于氧化酶(漆酶和过氧化物酶)和其他一些辅助酶，如H2O2酶。根据催化反应类型，过氧化物酶可分为锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)、多功能过氧化物酶(VP)和染料脱色过氧化物酶(DyP)[4]。MnP是一种胞外血红素蛋白，具有Mn2+活性中心。反应时Mn2+被氧化生成Mn3+，扩散或渗透到植物细胞内部，然后Mn3+氧化苯酚生成苯氧残基[16]。MnP的氧化/还原电位较低，只能氧化降解酚型木质素[4]。LiP可被H2O2激活，从苯环结构获得一个电子，发生单电子氧化反应形成苯氧自由基，随后通过链式反应产生其他类型的自由基，导致侧链中的主要化学键断裂[41]，LiP的氧化/还原电位极高，能够独自氧化非酚型的木质素。而VP则结合了MnP和LiP的催化降解策略，被认为是第三类木质素降解过氧化物酶[40]。DyP在结构上与其他过氧化物酶不同，其具有广泛的底物作用范围，主要在酸性pH值下活跃，该酶可能同时具有氧化和水解作用[42]。

3.2 漆酶

漆酶(Lac)是一种多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族，具有广泛的催化底物，主要包括酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类化合物[43]。大多数漆酶均具有一个单核中心(T1Cu)和一个三核中心(T2Cu 和T3Cu)，结合有4个铜离子，形成特定构型的三核铜簇活性中心。细菌漆酶的氧化/还原电位较低，担子菌白腐真菌的氧化/还原电位相对较高且具有更强的催化活性，在木质素降解中起主要作用。但是细菌漆酶对温度、pH值的耐受性更强，更适于工业化应用[44]。据报道，真菌漆酶耐受pH值3.0～7.0，温度20～50 ℃，而细菌漆酶耐受pH值1.0～7.2，温度30～85 ℃[4]。 地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、亚硝酸单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)和嗜热细菌(Thermusthermophilus)都显示具有漆酶活性，并且大部分细菌漆酶基因主要分布在链霉菌和芽孢杆菌目[45]。

3.3 降解机制

到目前为止，研究的所有微生物其降解木质素的整体机制具有显著的相似性。总体来说，多种高活性氧化酶参与强氧化还原过程，产生自由基或氧化还原介质[39]，与酶相比这些活性分子更小，可以进入木质素的三维结构，并在分子内形成化学键。随后木质素降解化合物被特定的微生物攻击，进一步降解、修饰或最终打开芳香环结构(图1)。木质素最终降解产物取决于可用的电子受体。在好氧环境中是CO2，而在不同的厌氧环境中可能是H2S、NH4或甲烷[15]。木质素的降解途径主要包括部分水解，芳香基、烷基醚、醚键和C—C键的断裂，脱甲氧基化、烷化和缩合反应。其中，Cα—Cβ键的断裂较容易，同时β-O- 4醚键先于其他键断裂。在较低温度的温和条件下，醚键和C—C键断裂，生成酚类单体化合物和二聚化合物[46]。

图1 木质素微生物降解模型[10]

4 微生物降解木质素的工业应用

相比于物理化学方法，生物降解通常在温和的条件下进行，有利于产品的选择性和环境友好性。其中以白腐菌和褐腐菌为代表的真菌降解木质素已应用到酚类化合物的生物修复、生物制浆以及木质素产物精炼等领域[4]，木质素降解细菌则可用于制浆造纸废水处理、聚羟基烷酸酯(PHA)、脂质生物燃料、食品添加剂香兰素、生物肥料等的生产。

4.1 脂类

微生物可将木质素转化为油脂，成为生产生物柴油的原料。红球菌可通过β-酮己二酸途径代谢木质素基化合物合成脂质。红球菌 RHA1可通过苯乙酸(PAA)途径利用辅酶A (CoA)实现芳香酸的衍生化，而不需要开环催化。这使得芳香衍生的碳元素可穿梭进入CoA，成为脂肪酸合成和脂质积累的必要前体[47]。同时木质素衍生的芳香族小分子化合物更容易被微生物代谢，因此适当的预处理有利于微生物脂质的积累。皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)[48]、虎皮香菇(Lentinustigrinus)[49]等产油酵母和真菌也能够利用木质素积累油脂。

4.2 生物塑料

聚羟基烷酸酯(PHA)是一种可由微生物合成的可降解聚合物，在涂料、薄膜、生物医用材料、生物相容性给药材料、有机/无机复合材料等方面具有广泛的应用，可作为传统化石来源塑料的替代品[50]。虽然真菌是木质素高效降解的优势微生物，但是真菌缺乏PHA合成相关酶。细菌包括贪铜菌(Cupriavidusbasilensis)[51]、真氧产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)[52]、恶臭假单胞菌[53]和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)[4]等均被报道具有以木质素及其衍生物合成PHA的能力。其中，恶臭假单胞菌KT2440可通过相关代谢途径将芳香类化合物转化为PHA，该菌可利用木质素基芳香族化合物合成长链PHA，并已进行中试生产[53]。

4.3 香兰素

香兰素(3-甲氧基- 4-羟基苯甲醛)是一种重要香料，广泛应用于食品添加剂、日用品、保健品等领域。利用木质素衍生产品生产香兰素已得到广泛的研究。链霉菌V-1被认为是最具发展前景的香兰素生产菌之一，可利用阿魏酸为底物合成香兰素。此外，红球菌、枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)[54-56]等细菌能代谢米糠、竹片、阿魏酸合成香兰素。通过基因工程可以提高香兰素的产量。已研究发现删除红球菌RHA1Δvdh基因、恶臭假单胞菌 GN299 lapABC 操纵子(GN23)有助于香兰素的积累[57]。 链霉菌中的fcs和ech基因也被证实是香兰素合成的关键基因，当将这两种基因在大肠杆菌体内表达时，10 h内阿魏酸到香兰素的转化率可达94.3%[58]。

4.4 废水处理

制浆造纸工业产生了大量含有木质素的黑液，直接排放会造成环境污染，并对水生动植物产生危害[4]。为了处理黑液，大部分造纸厂需要建立专门的废水处理工段，需要消耗大量的化学药品且运行费用昂贵。采用细菌、真菌等微生物处理方法，可将黑液中的木质素转化成乙二醇、对羟基苯甲酸、香草酸等高附加值化学品，使得黑液的预处理更加经济和环保[59]。相比单菌培养，混菌共培养可有效降低黑液的色度以及化学需氧量(COD)等污染参数[60]，并且GC-MS分析表明处理后木质素分子质量降低，说明菌群能够利用木质素成分作为碳源生长[61]。

偶氮染料是纺织工业使用的主要染料，具有抗酸、抗碱、抗光、抗微生物降解等特性，是毒性大且难降解的芳香类化合物之一[62]。细菌木质素降解酶如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、染料脱色过氧化物酶(DyP)和漆酶等证实具有降解偶氮染料和其他纺织染料的能力[63]，其中DyP的降解能力要优于其他酶。嗜热放线菌(Thermobifidafusca)分泌的DyP能够降解大多数染料[64]。而来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PKE117的重组DyP过氧化物酶(DyPPa)在酸性条件下能够降解多种蒽醌染料[65]。沙链霉菌 (Streptomycespsammoticus)分泌的漆酶也被报道能够在短时间内使得雷玛唑亮蓝色度降低80%[66]。

5 结语与展望

作为地球上最丰富的可再生芳香化合物，木质素的解聚与利用对自然界碳循环意义重大。微生物介导的木质素降解途径因其低能耗、对环境友好等优点成为研究的热点。由于具有广泛的环境适应性以及便于遗传操作，细菌成为木质素解聚的新手段，并将成为木质纤维原料预处理、木质素资源化利用及废水处理的重要候选菌种。未来研究需要挖掘更多的新型木质素降解菌株，特别是厌氧或微氧等条件，可能成为新菌株的筛选来源并揭示木质素解聚和转化的新机制。尽管研究报道认为微生物能够将木质素转化成多种具有工业应用价值的化学品，但是目前的难点是产物得率较低。未来可通过扩大目标菌株筛选范围、代谢工程抑制副产物合成、基因工程构造木质素高效重组菌等手段，实现木质素细菌降解产业化。