新型冠状病毒疫苗的研发现状及展望

李晓瑞，李兴航综述，严汉池审校

1.天津大学生命科学学院，天津310110；2.武汉生物制品研究所，湖北 武汉430207

2020年1月12日，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）正式将引起新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的病原体命名为“2019新型冠状病毒”（2019 novel corona virus，2019-nCoV），国际病毒分类学委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）。SARS-CoV-2导致的COVID-19大流行给人类健康和全球经济造成了重大损失且，尚未发现特效的抗病毒药物，因此，接种疫苗成为有效防治疾病的策略。鉴于SARSCoV-2与2003年暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory symptom coronavirus，SARSCoV）和2012年暴发的中东呼吸综合征冠状病毒（Middle Eastern respiratory syndrome-related coronavirus，MERS-CoV）均属于冠状病毒［1］，因此，在新型冠状病毒疫苗（简称新冠疫苗）的研究中，结合了研发SARS-CoV和MERS-CoV疫苗的经验，迅速提出了灭活疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗和减毒活疫苗这5大新冠疫苗的主要研究路线，同时也在尝试运用反向疫苗学和疫苗组学等新兴概念进行疫苗的设计［2-3］。本文对目前正在研发和临床试验的各类SARS-CoV-2疫苗以及研发所面临的挑战作一综述。

1 SARS-CoV-2简介

SARS-CoV-2属于β属冠状病毒（Betacoronavirus Coronavirdae，β-CoV），是一种有包膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，基因组编码4种结构蛋白：刺突糖蛋白（spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜糖蛋白（membrane glycoprotein，M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid，N），其中S蛋白形成三聚体结构，负责识别并结合宿主细胞表面的受体，是一种主要的保护性抗原，可诱导机体产生高效价中和抗体（neutralizing antibody，Nab），在防止病毒感染过程中发挥重要作用［1］。S蛋白直接与宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）结合进入上皮细胞引起感染，促进病毒增殖［4-6］，目前，大多数新冠疫苗的设计正是针对S蛋白。

2 新冠疫苗的研究策略

自从SARS-CoV-2的基因序列公布以来，全世界的科研人员均在加快速度研发针对COVID-19的疫苗，这些候选疫苗的类型、研究进展、优势以及存在的问题见表1。

2.1 灭活疫苗（inactivated virus vaccine） 灭活疫苗通常是选用免疫原性强的病原体，经大量培养后，采用理化方法进行灭活而制成的疫苗。最经典的灭活疫苗的研究途径是先对病毒灭活处理后进行多次纯化，如脊髓灰质炎和流感疫苗，其安全性和有效性已得到广泛认可［7-8］。针对SARS的灭活疫苗，在恒河猴、雪豹模型中能产生高滴度中和抗体［9-10］，SARS灭活疫苗Ⅰ期临床试验表明，其对人体安全有效，耐受性强［11］。2020年4月13日，国药集团中国生物技术股份有限公司（简称国药中国生物）武汉生物制品研究所SARS-CoV-2灭活疫苗进入临床试验，该疫苗是世界上第一支进入临床的灭活疫苗。2020年6月16日宣布了该疫苗的揭盲结果，Ⅰ／Ⅱ期临床研究受试者已全部完成2针次接种，疫苗接种后安全、有效，受试者均产生了高滴度抗体，18～59岁组中按照0，14 d和0，21 d程序接种两剂后，中和抗体阳转率达97.6%；按照0，28 d程序接种两剂后，中和抗体阳转率达100%［12］。另一个值得关注的是北京科兴中维生物技术有限公司（简称科兴中维）研制的新冠灭活疫苗克尔来福，GAO等［1］发表了SARS-CoV-2灭活病毒疫苗（PiCo Vacc）临床前研究的最新成果，PiCoVacc可在小鼠、大鼠和恒河猴动物模型中诱导出SARS-CoV-2特异性中和抗体，证明了PiCoVacc在恒河猴中的安全性和有效性。2020年6月14日公布了该疫苗的Ⅰ／Ⅱ期临床试验结果，初步显示具有良好的安全性和免疫原性，科兴中维与巴西展开合作，双方将在巴西共同开展Ⅲ期临床试验［13-14］。此外，国药中国生物北京生物制品研究所、中国医学科学院医学生物学研究所研制的SARS-CoV-2灭活疫苗也均在开展Ⅰ／Ⅱ期临床试验。

2.2 重组蛋白疫苗（recombinant protein vaccine）重组蛋白疫苗是将某种病毒的目的抗原基因构建在表达载体上，将已构建的表达蛋白载体转化到细菌、酵母或哺乳动物或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，纯化后制备的疫苗。该类疫苗目前有两种研究方案：针对S蛋白的疫苗和病毒颗粒样蛋白（virus-like particles，VLPs）［15-16］。S蛋白是SARSCoV-2与人体细胞上ACE2受体结合的部位，可在体外表达出S蛋白，再用于疫苗的制备，如美国Novavax公司研发的重组S蛋白纳米颗粒疫苗。VLPs是通过病毒外壳模拟冠状病毒的结构来诱导免疫应答。美国GeoVax公司采用改良痘病毒（modified vaccinia virus Ankara，MVA）作为疫苗表达载体，选择SARSCoV-2的S蛋白作为核心抗原，共表达蛋白并协助VLPs的组装，利用VLPs激活免疫应答，目前正准备进行动物模型试验以及Ⅰ／Ⅱ期临床试验［17］。

2.3 病毒载体疫苗（viral vector-based vaccine）病毒载体疫苗是将病毒作为载体，利用基因工程技术将外源保护性抗原基因插入病毒的基因组内，再转染细胞获得重组病毒，它们能在机体内表达目的蛋白，并诱导产生相应的抗体，进而获得免疫力。常用的病毒载体有腺病毒（adenvirus）、痘病毒（proxvirus）、疱疹病毒（herpes simples virus，HSV）等。2017年，康希诺生物股份有限公司（简称康希诺）与军事科学院军事医学研究院陈薇院士团队以腺病毒为载体研发了埃博拉病毒疫苗（Ad5-EBOV）［18］。联合研发的以腺病毒为载体的重组SARS-CoV-2疫苗（Ad5-nCoV）于2020年3月17日获批进入Ⅰ期临床试验，108名志愿者已完成接种，2020年4月9日招募Ⅱ期临床试验志愿者［19-21］。2020年5月22日，该团队发布了Ad5-nCoVⅠ期临床试验数据，108名接种者全部有显著的细胞免疫反应，表明Ad5-nCoV安全性和耐受性良好，能在人体内产生抗SARS-CoV-2的免疫应答。接种单剂量Ad5-nCoV第14天后，中和抗体滴度明显增长，第28天后，抗体几何平均滴度超过接种前4倍。特异性T细胞反应也达到峰值，表明Ad5-nCoV能够诱导高效的体液和细胞免疫［22］。

2.4 核酸疫苗（nucleic-acid vaccine）核酸疫苗包括DNA和mRNA疫苗。DNA疫苗是直接将编码病毒抗原基因的DNA序列（常用质粒）注入到宿主内，使病毒的抗原蛋白在宿主体内表达以诱导体液和细胞免疫。研发机构可根据SARS-CoV-2的基因序列直接生产疫苗。mRNA疫苗是将病毒抗原的mRNA制为疫苗，注入宿主内的mRNA可表达病毒的抗原蛋白，从而诱发机体产生免疫应答。核酸疫苗由于本身独特的优势，如在体内可持续性表达，可诱导体液和细胞免疫，维持时间长，是目前热门的新冠疫苗研发方向。

2020年3月16日，美国Moderna公司研发的COVID-19疫苗（mRNA疫苗，mRNA-1273）进行Ⅰ期临床试验的申请［23］。2020年5月18日，Moderna mRNA-1273在Ⅰ期临床试验显示出一定的安全性和免疫原性，18～55岁受试者在注射25、100μg mRNA-1273后，体内产生了新冠抗体，抗体水平与疫苗剂量相关，其中2个剂量水平的8名志愿者达到或超过了恢复期血清中常见的中和抗体滴度。第2针接种14 d后，25μg剂量组志愿者体内抗体水平与病毒感染患者康复后抗体水平相当，而100μg剂量组抗体水平显著高于康复感染患者。Moderna公司已开始准备mRNA-1273的Ⅱ／Ⅲ期临床试验［24-26］。对美国INOVIO研发的DNA疫苗（INO-4800）已进行动物试验。经INO-4800免疫后，小鼠和豚鼠可产生能中和S蛋白的中和抗体。INO-4800在临床前模型中显示能产生有效的中和抗体和T细胞免疫应答［27］。

2.5 减毒活疫苗（live attenuated vaccine） 该路线是将病毒进行减毒后制成疫苗。LAM等［28］发现，SARSCoV-2与穿山甲体内的某个冠状病毒RBD氨基酸序列相似性高达97.4%，研究者希望从动物冠状病毒中找到具有交叉保护作用，同时对人无致病性的毒株，作为新冠疫苗候选株进行后续研发。2020年6月18日，美国Codagenix宣布与印度血清研究所合作研发的减毒活疫苗CDX-005目前正进行动物安全性和有效性试验，与SARS-CoV-2相比，其毒性明显减弱，预计7月初将获得临床前数据［29］。

此外还有一种基于流感病毒载体的研究策略，香港大学的研究者基于DelNS1流感疫苗系统，结合反向遗传学技术，在DelNS1系统表达外源抗原，并已成功研制出MERS疫苗（DelNS1-MERS-CoV）［30］。这种DelNS1疫苗仍具备完整的流感病毒颗粒，带有普通流感病毒的表面蛋白，但能同时在NS1上表达冠状病毒S蛋白抗原，实验结果表明，此系统能够有效表达MERS-CoV RBD或N蛋白［31］。考虑到冠状病毒RBD功能的相似性，研究者提出可利用此平台快速研制DelNS1-2019nCoV疫苗［32］。

2.6 利用反向遗传学和疫苗组学的研究策略 反向疫苗学是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原的疫苗研发策略。其以微生物基因组为平台，对毒力因子、外膜抗原、侵袭及毒力相关抗原等蛋白基因进行高通量克隆、表达，纯化出重组蛋白，再对纯化后的抗原进行体内、体外评价，筛选出保护性抗原，进行疫苗研究［33-34］。近日，ONG等［35］使用Vaxign反向疫苗学工具以及新开发的Vaxignl-ML机器学习工具用于预测COVID-19候选疫苗。除了常用的S蛋白外，非结构蛋白3（non-structural protein 3，Nsp3）目前尚未在任何冠状病毒疫苗研究中作为候选靶标。Nsp3在SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERSCoV中的保守性远高于感染人和其他动物的15种冠状病毒。并提出含有结构蛋白（structural protein，Sp）和非结构蛋白（Nsp）的“p-u002FNsp混合疫苗”。

表1 新冠疫苗的类型、研究进展、优势及存在的问题Tab.1 Type，progress，advantage and problem in development of 2019-nCoV vaccine

3 新冠疫苗的展望与挑战

新疫苗的安全和有效仍是研发的第一位，但同时存在一些挑战。首先是常出现在冠状病毒疫苗的ADE，ADE会在接种疫苗后加重病毒感染，中和抗体水平越低时感染越严重［37-39］。有研究表明，SARS、HIV和埃博拉病毒（Ebola virus，EV）会出现ADE现象［39-41］，COVID-19是否存在ADE效应暂时尚无明确报道。

对于核酸疫苗而言，DNA疫苗的缺点在于需要特殊的接种设备，且外源性DNA可能会与自身细胞的DNA整合，因此，DNA疫苗的安全性值得关注［42］。mRNA疫苗不稳定，易降解，且mRNA能否顺利进入宿主细胞，产生具有免疫原性的目的蛋白，也是一个关键问题［43］。

SARS-CoV-2的变异情况也备受关注，KORBER等［44］研究发现了S蛋白突变，第614位的天冬氨酸（D614）突变成甘氨酸（G614），G614的传染性更强。自2020年3月以来，G164已成为全球主要的流行毒株，所占比例持续增加。突变后其传播能力增强，感染后机体内病毒载量增加，而毒力并未发生明显变化，类似的突变是否会对疫苗的有效性产生影响还亟待研究，需密切关注其突变情况，尤其是RBD序列的变异情况。最后，新冠疫苗的研发多数已进入Ⅰ／Ⅱ期临床试验，证实了疫苗的安全性，且有一定的免疫原性，在国内疫情大体控制的情况下，如何合理设计与开展Ⅲ期临床试验以及新型疫苗的可获得性，包括疫苗的成本和获得途径，能否迅速规模化生产等，均是所要面临的挑战。

SARS-CoV-2全球大暴发影响了数十亿人的正常生活。帝国理工学院的FERGUSON等［45］建模表明，如无特效疫苗出现，封城、社交隔离与社会的解封将会持续循环下去。因此，研发针对COVID-19的疫苗和特效药物是唯一有效的方法，对预防病毒感染和疫情防控具有重要意义。