白介素-36α在烟曲霉感染的人角膜上皮细胞免疫反应中的作用及其机制

张子悦 郑恒睿 马玉娜 吴媛 王谦 徐强 张杰 林静

(青岛大学附属医院眼科，山东 青岛 266003)

真菌性角膜炎是一种高致盲率的感染性角膜病变。近年来，真菌性角膜炎发病率逐年升高，广谱抗生素、糖皮质激素以及角膜接触镜的不规范使用，都增加了真菌性角膜炎的发病风险[1]。烟曲霉菌是我国真菌性角膜炎主要致病真菌之一[2]，而在烟曲霉菌感染中适当的炎症反应对致病病原体的清除至关重要[3]。白细胞介素-36(IL-36)是近年来新发现的IL-1细胞因子家族成员，可以与特异性IL-36受体(IL-36R)结合，激活胞内信号传导通路，发挥促炎作用。IL-36由IL-36α、IL-36β和IL-36γ组成，与多种炎症性疾病有关[4]。在流感病毒小鼠肺炎模型中，肺泡上皮细胞中IL-36α表达量高于IL-36γ，并且IL-36α能够加速炎症细胞因子和趋化因子的分泌[5]。IL-36α可与IL-36R特异性结合，激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)信号转导途径[6]，促进趋化因子等多种细胞因子分泌[7]，在溃疡性结肠炎或肾炎等多种炎性疾病中起到促炎作用[8-10]。已有研究证明，念珠菌感染后口腔黏膜上皮细胞中IL-36α以及IL-36γ的表达增加，经IL-36R信号通路生成IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等促炎因子，发挥促炎作用[11-13]。GUO等[14]研究显示，铜绿假单胞菌感染的小鼠角膜中IL-36α的表达显著升高，促进上皮细胞分泌多种炎症因子并促进细菌清除，提示IL-36α在感染性角膜炎中高表达并起到促炎作用。但IL-36α在烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞中的表达情况及其作用机制，尚未见相关研究报道。本研究通过体外实验探讨IL-36α在烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞中的表达情况，以进一步揭示IL-36α在真菌性角膜炎免疫反应中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

永生化人角膜上皮细胞(HCEC)由广州市中山眼科中心眼表实验室提供，烟曲霉菌(菌株3.0772)购自中国微生物中心，人IL-36α重组蛋白(rhIL-36α)、人IL-36Ra重组蛋白(rhIL-36Ra)均购自美国R&D System公司，IL-36α、IL-36R多克隆抗体购自美国圣约翰公司，磷酸化NF-κB p65(pNF-κB p65)、NF-κB p65抗体购自美国Cell Signaling Tecnology公司，RNA裂解液购自中国大连TaKaRa生物公司，IL-8、TNF-α ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1烟曲霉菌灭活菌丝的制备 取冷冻保存的烟曲霉菌标准菌株，具体培育方式参考FAN等[3]的实验。使用DMEM高糖培养液将烟曲霉菌灭活菌丝终浓度调整为1.0×108CFU/L。

1.2.2HCEC细胞的培养及烟曲霉菌菌丝刺激实验 将HCEC细胞均匀接种于含有体积分数0.1的胎牛血清以及体积分数为10 g/L的青链霉素的DMEM细胞培养基的6孔或者12孔培养板中，于37 ℃含体积分数0.05 CO2无菌培养箱中培养6～8 h，当HCEC细胞汇合度约为80%时，以无菌PBS洗涤以后更换为无血清DMEM培养基，2 h以后再加入5×108CFU/L烟曲霉菌灭活菌丝刺激HCEC细胞。

1.2.3RT-PCR实验检测HCEC细胞中IL-36α、IL-36R、IL-8及TNF-α mRNA表达水平 以烟曲霉菌灭活菌丝刺激HCEC细胞0、4、8、12、16 h后，检测各个时间点HCEC细胞中IL-36α、IL-36R mRNA表达。将HCEC细胞分为A、B、C组,A组仅给予100 μg/L的IgG重组蛋白处理HCEC细胞8 h，而B、C组分别给予100 μg/L IgG重组蛋白、100 μg/L rhIL-36α预处理细胞1 h后加入烟曲霉菌灭活菌丝刺激HCEC细胞8 h，检测A、B、C组HCEC细胞中IL-8及TNF-α mRNA表达水平。按照实验需要将HCEC细胞分为G、H、I组，G组为单纯DMEM培养基培养8 h的HCEC细胞，H组给予烟曲霉菌灭活菌丝刺激8 h，I组给予Dectin-1中和抗体预处理HCEC细胞2 h后,加入烟曲霉灭活菌丝刺激HCEC细胞8 h后，检测G、H、I组中IL-36α mRNA的表达水平。将细胞收集于500 μL RNA裂解液中，以分光光度法测得RNA样本浓度后计算逆转录加样量。根据诺维赞逆转录试剂盒说明书的要求逆转录获得cDNA原液20 μL，使用DEPC水按照1∶25稀释后，取2 μL稀释液用于RT-PCR实验，最终总反应体积为20 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 45 s，60 ℃退火、延伸 30 s，95 ℃溶解15 s。实验重复3次，计算mRNA的表达水平。搜索GeneBank中人类β-actin、IL-36α、IL-36R、IL-8以及TNF-α对应的mRNA序列，委托中国大连TaKaRa生物公司设计合成引物。引物序列见表1。

1.2.4Western Blot方法检测HCEC细胞中IL-36α、IL-36R、NF-κB p65及pNF-κB p65蛋白的表达接种于6孔板中的HCEC细胞以烟曲霉菌灭活菌丝刺激0、8、12、24 h，检测各个时间点HCEC细胞中IL-36α、IL-36R蛋白表达变化。按照实验需要将HCEC细胞分为D、E、F组，D组为DMEM培养基培养12 h的HCEC细胞，E、F组分别给予100 μg/L rhIL-36α+rhIL-36Ra及100 μg/L rhIL-36α处理细胞12 h，检测D、E、F组细胞中NF-κB p65、pNF-κB p65蛋白的表达变化。按照实验需要将HCEC细胞分为G、H以及I组，G组为DMEM培养基培养12 h的HCEC细胞，H组给予烟曲霉菌灭活菌丝刺激12 h，I组给予Dectin-1中和抗体预处理HCEC细胞2 h后,加入烟曲霉灭活菌丝刺激HCEC细胞12 h后，检测G、H、I组细胞中IL-36α蛋白表达的变化。收集HCEC细胞于提前配制好的RIPA/PMSF蛋白裂解液中，每孔100 μL。冰上裂解2 h后，提取总蛋白并测定蛋白浓度，计算上样量，加入SDS-蛋白上样缓冲液并于109 ℃恒温加热器中加热7 min。另根据目的条带的相对分子量，制备体积分数为0.15的SDS-PAGE胶。跑胶的条件为：80 V恒压电泳60 min，转110 V恒压电泳90 min。低温250 mA湿转2 h后，使用PBST溶液洗膜，室温封闭2 h。4 ℃条件下孵育IL-36α、IL-36R、NF-κB p65、pNF-κB p65(phospho-NF-κB p65)及内参β-actin一抗(稀释浓度均为1∶1 000)12 h，复温1 h后PBST洗膜，加入1∶5 000倍稀释后羊抗兔来源二抗室温孵育2 h，使用ECL Western Blot方法检测试剂显影目的条带，采用Image J软件统计各组灰度值,结果取3次重复实验的均值。

1.2.5ELISA实验检测HCEC细胞中IL-8以及TNF-α在不同处理条件下蛋白表达的变化 HCEC细胞接种于12孔板上，A组仅给予100 μg/L的IgG重组蛋白处理HCEC细胞12 h，B、C组分别给予100 μg/L IgG重组蛋白、100 μg/L rhIL-36α预处理细胞1 h以后，加入烟曲霉菌灭活菌丝刺激HCEC细胞12 h，收集细胞上清液离心后取上清液，根据试剂盒说明书检测各组细胞中IL-8以及TNF-α蛋白的表达水平。所有样本均通过双复孔检测，具体操作按试剂盒说明书进行，用酶标仪在波长450 nm处测量的各个孔的吸光度值后减去在波长570 nm处测量的吸光度值，计算出各例标本中所测因子蛋白的含量。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 IL-36α在烟曲霉菌刺激的HCEC细胞中表达比较

RT-PCR检测结果显示，烟曲霉灭活菌丝刺激HCEC细胞，0、4、8、12、16 h后IL-36α mRNA的表达量分别为1.13±0.42、3.47±0.16、3.59±0.90、4.34±0.73、7.89±0.44，各时间点比较差异具有显著性(F=21.88，P<0.05)。IL-36R mRNA在0、4、8、12、16 h的表达量分别为0.43±0.17、1.21±0.50、6.45±0.17、6.17±0.68、5.46±1.32，各时间点比较差异均具有显著意义(F=92.76，P<0.05)。Western Blot方法检测结果示，0、8、12、24 h时IL-36α蛋白的表达量分别为7.61±0.30、10.04±0.41、10.73±0.42、14.15±0.51，IL-36R蛋白的表达量则分别为2.41±0.24、5.30±0.26、5.98±0.17、6.83±0.16，各时间点比较差异具有显著意义(F=249.74、260.18，P<0.05)。

2.2 IL-36α对烟曲霉感染的HCEC细胞促炎细胞因子表达的影响

各组细胞中IL-8和TNF-α蛋白与mRNA水平比较差异有显著性(F=11.54～95.42，P<0.05)；C组中IL-8、TNF-α蛋白与 mRNA的表达水平较B组升高，差异有显著性(P<0.05)。见表2。

表2 各组HCEC细胞中IL-8、TNF-α蛋白和mRNA表达水平比较

2.3 各组细胞中pNF-κB p65及NF-κB p65蛋白表达的比较

Western Blot方法检测结果显示，D、E、F组中HCEC细胞中pNF-κB p65蛋白的相对表达量分别为3.18±0.35、4.33±0.29、4.72±0.10，差异具有显著性(F=26.51，P<0.05)；与D、E组相比，F组中pNF-κB p65蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。D、E、F组中NF-κB p65蛋白的相对表达量分别为0.70±0.12、1.28±0.07、1.60±0.08，差异具有显著性(F=37.96，P<0.05)；与D组相比，E、F组中NF-κB p65蛋白的表达水平明显升高(P<0.05)。

2.4 各组细胞中IL-36α蛋白以及mRNA表达水平的比较

RT-PCR结果显示，G、H、I组HCEC细胞中IL-36α mRNA相对表达量分别为0.69±0.21、4.31±0.28、1.28±0.46，差异具有显著性(F=70.99，P<0.05)；与H组相比，I组IL-36α mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。Western Blot实验结果显示，G、H、I蛋白相对表达量分别为1.30±0.07、2.85±0.15、2.10±0.14，差异具有显著性(F=34.26，P<0.05)；与H组相比，I组HCEC细胞IL-36α蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。

3 讨 论

烟曲霉菌感染引起的真菌性角膜炎是一种严重的感染性眼病，因缺乏有效的治疗方式，致盲率一直居高不下[15-17]。IL-36α是新型细胞因子IL-1家族成员，在多种炎性疾病中与IL-36R结合后激活下游信号通路，诱导促炎因子的产生[4，7，18]。在烟曲霉菌引起的HCEC细胞的感染中，IL-36α表达升高并起到促炎作用，加重了角膜的炎症反应。

本研究结果显示，经烟曲霉菌刺激的HCEC细胞与正常HCEC细胞相比，IL-36α和IL-36R的蛋白及mRNA水平均明显升高。已有研究证实，在正常生理条件下，IL-36α在皮肤、脑、外周血细胞、肺、肠等多种细胞、组织和器官中均有表达，当受到LPS、微生物等病原体刺激后[19-21]，如白色念珠菌感染的口腔黏膜上皮等组织中[11]，IL-36α表达升高，引起组织炎症反应。本实验结果显示，IL-36α在烟曲霉菌灭活菌丝刺激的HCEC细胞中表达升高，提示IL-36途径可能参与烟曲霉感染引起的免疫炎症反应，IL-36α可能在烟曲霉菌感染的早期免疫反应中起着重要的作用。

本实验进一步检测了经rhIL-36α预处理后，烟曲霉菌感染的HCEC细胞中促炎因子的表达情况。结果显示，rhIL-36α显著上调了烟曲霉菌感染的角膜组织中促炎因子IL-8、TNF-α的表达。IL-8以及TNF-α是免疫反应中重要的趋化因子和炎症因子，可以激活免疫细胞。实验中外源性使用IL-36α重组蛋白增加了烟曲霉菌引起的HCEC细胞促炎因子的产生，进一步说明IL-36α诱导促炎因子的产生并加重烟曲霉菌感染后HCEC细胞中的炎症反应。GUO等[14]的研究证实，IL-36α在铜绿假单胞菌角膜炎中表达显著增高，并促进HCEC细胞分泌多种促炎因子。本实验证明烟曲霉菌的刺激可以引起HCEC细胞当中IL-36α表达水平升高，外源性的rhIL-36α的加入上调了炎症因子的表达，因此在真菌性角膜炎中IL-36α起到促炎作用。

在肾小管上皮细胞中IL-36细胞因子可以通过IL-36R激活NF-κB，在IL-36R基因敲除小鼠肾组织中NF-κB的活化降低[13]。NF-κB是炎症级联反应的关键调节因子，可以快速响应炎性刺激并控制炎症细胞因子的转录(如IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α)[22-23]。NF-κB的激活涉及自身磷酸化和随后的抑制蛋白IκB蛋白的水解，随后磷酸化的NF-κB易位至细胞核并启动下游炎性递质的转录[24-25]。已有研究证明，诸如烟曲霉等细胞外刺激可促进IκB的水解，然后实现NF-κB易位到细胞核中并与邻近“靶标”基因序列结合,IL-36α可以通过IL-36R激活NF-κB[7，23，26]。另外与IL-36α不同，IL-36Ra是IL-36R的负调控因子，IL-36Ra竞争性结合IL-36R从而抑制IL-36胞内信号的转导[27]。本研究Western Blot方法检测结果显示,与E组相比，F组HCEC细胞中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平明显增强，rhIL-36Ra的加入则明显抑制了NF-κB的磷酸化。于急性肾损伤(AKI)模型中，外源性加入IL-36α可以上调肾小管上皮细胞中NF-κB活性，从而促进下游炎症因子的产生[6]。在本实验中，外源性加入人IL-36α重组蛋白显著上调了NF-κB的磷酸化水平，提示IL-36α的促炎作用可能是通过活跃的NF-κB信号途径起作用。

在人外周血单个核细胞(PBMC)中，烟曲霉对于IL-36α的诱导是通过Dectin-1/Syk和TLR4途径介导的[13，28-30]。本次实验中，在烟曲霉菌刺激HCEC细胞之前用Dectin-1中和抗体预处理阻断Dectin-1通路后，RT-PCR及Western Blot方法检测结果表明，Dectin-1中和抗体预处理组烟曲霉菌灭活菌丝刺激引起的IL-36α的表达显著降低。或许可以推断，在HCEC细胞中烟曲霉菌诱导的的IL-36α表达升高可能是通过Dectin-1途径介导的。

总之，本实验的研究结果证明了烟曲霉菌刺激的HCEC细胞通过Dectin-1介导的信号通路提高了IL-36α的表达，并诱导炎症因子加重炎症反应。同时，在HCEC细胞中，IL-36α可通过IL-36R/NF-κB信号通路进一步发挥促炎作用，IL-36α可提高炎症因子的表达，炎症因子TNF-α等的刺激还可以使IL-36α的表达进一步上调，形成正反馈通路，放大炎症反应。