瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6及组织中caspase-3基因表达的影响

孙华，肖开永，刘利君

急性心肌梗死（AMI）是指冠状动脉（冠脉）急性、持续性缺血缺氧所导致的心肌坏死，可导致恶性心律失常、休克或心力衰竭等，严重威胁患者的生命安全[1]。研究表明，心肌纤维化为心力衰竭（心衰）的独立危险因素之一，AMI后阻断心肌纤维化进程是防治心衰的关键，而心肌纤维化与炎性反应及细胞凋亡有关[2]。瑞舒伐他汀是他汀类降血脂药，其在抑制氧化应激、细胞凋亡、心肌纤维化等方面作用逐渐被证实[3]。本研究拟通过探讨瑞舒伐他汀对AMI大鼠血清C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎性因子及组织中细胞凋亡相关基因caspase-3表达情况影响，为其治疗相关机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 40只雄性清洁级健康SD大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，平均（220±20）g；瑞舒伐他汀[阿斯利康药业（中国）有限公司，国药准字J20170008，规格：10 mg]；大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；SP免疫组化检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体购自艾美捷科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型构建及分组 根据文献[4]步骤构建大鼠AMI模型：腹腔注射3%戊巴比妥钠，固定四肢，气管插管，插管远端连接小动物呼吸机，四肢皮下连接心电记录仪，第3肋肋间离断行开胸术，充分暴露心脏，左心耳下进针缝扎前降支。建模成功标准：结扎处左心室组织呈苍白色，心电图ST-T段呈弓背上抬高。无出血后，逐层缝合关胸。Sham组大鼠仅行前降支穿线而不结扎。术后24 h再行心电图检查证实AMI情况。建模成功后将术后24 h内存活的21只模型大鼠随机分为模型组（Model组，10只）、瑞舒伐他汀组（11只）。术后1 d起，Sham、Model组予以1 mg/kg·d生理盐水灌胃处理，瑞舒伐他汀组予以1 mg/kg·d瑞舒伐他汀灌胃处理，连续用药4周。

1.2.2 标本采集 血清标本：大鼠麻醉后，采集3 ml心脏血，3000 r/min离心处理15 min，分离血清，于-80℃冷存待检。组织标本：干预4周后，大鼠麻醉称重，断头处死，快速开胸，摘除心脏，生理盐水反复冲洗，采集近基底部梗死区心肌组织，置入中性福尔马林溶液内固定24 h，石蜡包埋，制成4 μm切片。

1.2.3 血清CRP、TNF-α、IL-6水平检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测待测血清标本中的CRP、TNF-α、IL-6水平，采用美国Bio Tek ELx800全自动酶标仪于450 nm波长处测得待测标本吸光度（OD）值，并绘制标准品回归曲线，以OD值计算出待测标本浓度，严格按照试剂盒及仪器说明书进行操作。

1.2.4 心肌组织caspase-3基因表达检测 caspase-3蛋白检测：免疫组化SP法：①石蜡切片，常规脱蜡；②高压抗原修复；③阻断灭活内源性过氧化物酶；④滴加羊血清封闭；⑤滴加采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）稀释至1:100兔抗大鼠caspase-3一抗，PBS冲洗；⑥滴加经辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗；⑦滴加链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶（SP）；⑧二氨基联苯胺（DAB）显色；⑨苏木素复染；⑩脱水、透明、封片、镜检。设置PBS代替一抗为阴性对照。每份标本取3张切片，显微镜下评估caspase-3蛋白表达情况，判定标准[5]为：细胞核、细胞浆内存在棕黄色、棕褐色颗粒即为阳性。采用病理图形文字分析软件测定阳性细胞表达区，每张切片选择4个阳性表达区内视野，每个视野计数200个caspase-3蛋白阳性染色，该数值代表caspase-3基因蛋白表达水平，蛋白阳性指数（PI）=（阳性细胞数/视野内细胞总数）×100%。

caspase-3基因半定量分析：RT-PCR法：总RNA提取及cDNA逆转录合成均按照文献[6]所述进行。PCR扩增：检索基因库中大鼠caspase-3基因的cDNA序列，以β-actin为内参进行扩增，引物序列为：caspase-3：上游引物：5’-CTGGACTG CGGTATTGAGAC-3’，下游引物：5’-CCGGGT GCGGTAGAGTAAGC-3’，β-actin：上游引物：5’-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游引物：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3’。反应体系为：2.5 μl cDNA+2.5 μl PCR缓冲液+0.1 μl上游引物+0.1 μl下游引物+7.2 μl灭菌水+0.1 μl Taq酶+2 μl dNTP。反应条件为：预变性：95℃，40 s→60℃，40 s→72℃，1 min，共36个循环，再72℃反应10 min冷存待检。以caspase-3/β-actin值表示caspase-3基因的mRNA表达水平。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 22.0软件处理。正态分布计量资料以（±s）表示，三组间比较行单因素方差分析，两两对比采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清CRP、TNF-α、IL-6水平比较 结果显示，Model组、瑞舒伐他汀组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平均高于Sham组，瑞舒伐他汀组血清CRP、TNF-α、IL-6水平均低于Model组，差异均有统计学意义（P均＜0.05），（表1、图1）。

2.2 三组心肌组织caspase-3基因表达情况比较 结果显示，Model组、瑞舒伐他汀组大鼠心肌组织caspase-3蛋白阳性指数、mRNA表达水平均高于Sham组大鼠，而瑞舒伐他汀组大鼠心肌组织caspase-3蛋白阳性指数、mRNA表达水平均低于Model组，差异均具有统计学意义（P均＜0.05），（表2、图2）。

表1 三组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比较

图1 三组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比较

表2 三组大鼠心肌组织caspase-3蛋白阳性指数、mRNA表达水平比较

图2 三组大鼠心肌组织caspase-3蛋白阳性指数、mRNA表达水平比较

3 讨论

心力衰竭是包括AMI在内的多种心血管疾病终末阶段，死亡率较高。研究显示，心力衰竭诱发心肌细胞外基质纤维化及心肌细胞损伤为AMI患者心功能恶化的基础病因[7]。心肌损伤时，其成纤维细胞大量分泌并生成肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞会产生过量胶原蛋白，致使心肌细胞外基质异常沉积，引发心肌纤维化，并最终引起心室重构，心功能恶化[8]。

既往研究认为，他汀类药物主要用于降血脂，降低心脑血管疾病风险。近年研究显示，他汀类药物除降脂外还具有如抗动脉粥样硬化，抑制血栓形成、免疫应答、氧化应激、心肌细胞凋亡及改善心功能等多重效应[9,10]。瑞舒伐他汀作为一类常用他汀药物，具有比其他他汀药物作用更强、作用时间更长的特点。戚凤君等[11]研究显示，瑞舒伐他汀可明显降低经皮冠状动脉介入治疗（PCI）后患者血清炎性因子水平。谢亚芹等[12]研究则表明，瑞舒伐他汀能明星降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡相关基因表达水平。因此，本研究通过构建大鼠AMI模型，探讨瑞舒伐他汀对AMI炎性因子及细胞凋亡的影响。

已有研究证实，炎性因子在AMI患者心肌纤维化进程中扮演重要角色。CRP为一种急性时相蛋白，被证实和心力衰竭、心肌梗死、高血压等发生有关。张立杰等[13]指出，CRP能以激活核转录因子信号通路、转化生长因子-β1信号通路及上调血管紧张素Ⅱ受体水平参与炎性反应，从而引发心肌纤维化。TNF-α为启动炎性反应最为重要的细胞因子，也称为前炎症细胞因子。陈强等[14]表明，TNF-α会抑制心肌收缩过程β受体活性及Ca2+活动，诱使心肌细胞、间质结构发生改变，从而损伤心肌功能。IL-6为一种主要由成纤维细胞、单核细胞分泌的细胞因子，具有多重效应，在机体免疫代谢过程中起关键作用。陈泽江等[15]研究显示，IL-6能诱导肝细胞分泌CRP，且此过程在炎症早期便可发生，促使血栓形成及纤维蛋白原分泌而损伤心肌细胞；此外，IL-6还诱导TNF-α水平升高而致使血管、内皮细胞功能异常，促使局部黏附因子聚集，导致心肌纤维化。本研究表明，Model组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平明显高于Sham组大鼠，而瑞舒伐他汀组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平明显低于Model组，提示瑞舒伐他汀能降低血清CRP、TNF-α、IL-6水平，从而抑制心肌纤维化进程，改善心肌功能。

张杰等[16]研究显示，细胞凋亡与AMI发生有关。心肌细胞为不可再生细胞，AMI早期伴随大量心肌细胞凋亡，而当凋亡水平超过周围细胞及局部巨噬细胞清除水平时，未被吞噬凋亡细胞会坏死、裂解，释放大量炎性因子，造成心肌实质细胞丢失，导致心室重构，进一步损伤心肌。细胞凋亡主要存在内源性途径及外源性途径两种相互关联途径，目前已发现caspase家族中的caspase-3参与了上述两种途径的细胞凋亡调控过程。caspase-3为细胞凋亡中级联反应最后通路，可直接引发细胞凋亡，也可通过破坏DNA修复相关酶、细胞骨架蛋白与其调节蛋白结构，抑制DNA修复，促使细胞凋亡[17]。本研究表明，Model组大鼠心肌组织caspase-3蛋白阳性指数、caspase-3 mRNA表达水平均明显高于Sham组大鼠，而瑞舒伐他汀组大鼠心肌组织caspase-3蛋白阳性指数、caspase-3 mRNA表达水平均明显低于Model组大鼠，提示瑞舒伐他汀可明显抑制caspase-3基因表达，从而抑制心肌细胞凋亡。

综上所述，瑞舒伐他汀可明显降低急性心肌梗死大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平，抑制心肌纤维化，下调心肌组织中caspase-3基因表达，从而抑制心肌细胞凋亡，改善大鼠心肌功能。