桑果原汁和桑果酒功效成分和抗氧化活性测定

杨金宏，陈正余，孟 刚，孔卫青

（安康学院/陕西省蚕桑重点实验室，陕西 安康 725099）

桑葚是由大量小核果集合而成为的聚花果果实，是国家“既是食品又是药品（1985）”的农产品之一，并被列入《中华人民共和国药典》，具有很高的食药用价值。桑葚富含黄酮、绿原酸、原花青、多糖、有机酸等活性物质，具有保护神经、提高免疫力、减肥、预防癌症、糖尿病、心血管疾病等功效［1］。同时，成熟桑葚还含丰富的花青素（矢车菊素-3-葡萄糖苷）（C3G）成分，具有抗氧化、抗衰老、增强血管弹性、消炎抗过敏等功效［1-3］。在韩国和日本，桑葚也被用于民间医药药理作用，包括退烧、治疗喉咙痛、肝肾保护、视力改善以及降血压等［4，5］。

桑葚可新鲜食用，也可干燥或加工成酒、果汁和果酱，味道鲜美，热量低、营养高，深受大众喜爱。随着近年来人们保健意识的增强，果酒以其低酒度、时尚、个性化等元素，很好地满足了人们对时尚酒精饮料的认同和追求。利用天然酿酒酵母，将新鲜桑葚榨汁糖发酵转化为酒精生产的桑果酒，酒质醇厚芳香、酒体清亮透明［6］，深受消费者喜爱，但相关制品活性成分的含量及其功效等未见研究报道。本研究对采摘自中度富硒土壤的桑果原汁和桑果酒进行研究，测定了其中的类黄酮、总酚、原花青素、绿原酸、C3G、木犀草苷和硒等的含量，及其总抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 桑葚品种红果2 号，采摘自安康市石泉县城关镇，选取成熟度高、含糖量高、无霉变及病虫害的新鲜桑葚，利用打浆机制作桑果原汁。桑果酒的制作：桑果原汁加入0.008%（W/V）SO2，0.1%（W/V）的酿酒酵母，22 ℃发酵7 d，桑果原汁和桑果酒在陕西博硒农业科技有限公司制作完成。

1.1.2 主要仪器设备 Agilent 1100 高效液相色谱仪、Thermo X Series II 电感耦合等离子体质谱仪。Millipore 超纯水系统、Multiskan Sky 全波长酶标仪，低温离心机Microfuge 22R、离心机Z-160M 等。

1.1.3 主要试剂 没食子酸、芦丁、儿茶素、绿原酸、木犀草苷标准品购于上海源叶生物科技有限公司；矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品来自中国计量所；硒标准储备液（1 000 μg/mL）购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；乙腈、硝酸为优级纯；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、稀盐酸、磷酸二氢钾等为分析纯，购自天津化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 总酚含量测定 分别取桑果原汁和桑果酒0.5 mL，针头式过滤器（0.22 μm）过滤，福林酚试剂法［7］测定其总酚含量，以没食子酸为标准品，测定760 nm 吸光度并制作标准曲线，计算桑果原汁和桑果酒总酚含量。

1.2.2 原花青素含量测定 原花青素含量测定采用香草醛法［8］，以儿茶素为标准品，测定 500 nm 吸光度并制作标准曲线，计算样品原花青素含量。

1.2.3 类黄酮含量测定 类黄酮含量的测定采用亚硝酸盐比色法［9］，以芦丁为标准品，测定 510 nm 吸光度并制作标准曲线，计算样品类黄酮含量。

1.2.4 绿原酸含量测定 绿原酸含量使用HPLC 方法［10］，流动相 A 为甲醇，B 为 1% 乙酸水，检测波长280 nm。配制0.5、2.0、16.0、80.0、200.0、400.0 μg/mL的绿原酸标准品溶液测定并制作标准曲线，计算样品绿原酸含量。

1.2.5 C3G含量测定 C3G含量测定方法同“1.2.4”，流动相A 为1.6%甲酸水溶液，B 为1.6%甲酸甲醇溶液，检测波长530 nm。配制2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的C3G 标准品溶液测定并制作标准曲线，计算样品的C3G 含量。

1.2.6 木犀草苷含量测定 木犀草苷含量测定方法同“1.2.4”，流动相A 为1%乙酸水溶液、流动相B 甲醇，检测波长350 nm。配制0.1、1.0、10.0、40.0、100.0、200.0 μg/mL 木犀草苷标准品溶液测定并制作标准曲线，计算样品木犀草苷含量。

1.2.7 硒含量测定 样品硒含量采用ICP-MS 方法［11］测定，配制 0、5、10、20、30 μg/L 的系列硒标准溶液，制作硒溶液标准曲线，计算样品硒含量。

1.2.8 对羟基自由基的清除作用 采用邻二氮菲-Fe2+比色法计算样品羟自由基清除能力［12］，测定样本吸光度记为A测，去离子水代替样品作对照的吸光度记为A对，去离子水代替H2O2测吸光度记为A空，根据公式D=（A测-A对）/（A空-A对）×100%计算样品的羟自由基清除率。

1.2.9 抗氧化活性测定 制备FRAP 工作液［13］，分别取桑果原汁和桑果酒6 μL，加入预热至37 ℃的FRAP 工作液 180 μL、ddH2O 18 μL，反应 20 min 后，酶标仪测定593 nm 吸光度，测定以双蒸水为空白对照。以0.2~1.6 mmol/L FeSO4溶液做标准曲线，以每克样本每分钟产生1 μmol Fe2+-TPTZ 定义为一个酶活力单位，计算样品的总抗氧化活性。

1.3 数据分析

所有样品均平行测定3 次，结果以x±s表示，显著性和极显著值分别为P<0.05 和P<0.01。

2 结果与分析

2.1 桑果原汁和桑果酒各成分含量测定结果

2.1.1 总酚含量测定结果 用没食子酸制作标准曲线，获得回归方程y=2.808x+0.001 2，R2=0.999 7，相关系数R2均大于0.99，说明吸光度与浓度之间存在较好的线性关系，试验的准确性高。进一步测得桑果原汁中总酚含量为（6.085±0.202）mg/mL，桑果酒总酚含量为（1.633±0.088）mg/mL，二者差异极显著（P=0.001 0）。

2.1.2 原花青素含量测定结果 获得标准曲线的回归方程为y=0.009 7x+0.000 6，R2=0.999 9。测得桑果原汁和桑果酒的原花青素含量分别为（1.838±0.097）、（0.345±0.071）mg/mL，二者差异极显著（P=0.002 7）。

2.1.3 类黄酮含量测定结果 获得标准曲线的回归方程为y=2.51x+0.000 7，R2=0.999 6。测得桑果原汁和桑果酒的类黄酮含量分别为（7.675±0.142）、（0.570±0.063）mg/mL，二者差异极显著（P=0.000 2）。

2.1.4 绿原酸含量测定结果 绿原酸的保留时间是6.157 min，绿原酸标准品制作的标准曲线回归方程为y=15.371x-15.504，R2=0.999 6，相关系数R2均大于0.99，说明峰面积与浓度之间存在较好的线性关系。测得桑果原汁和桑果酒的绿原酸含量分别为（11.550±0.508）、（1.453±0.108）μg/mL。

2.1.5 C3G 含量测定结果 C3G 的保留时间是24.793 2 min（图 1），测得桑果原汁中 C3G 含量为81.476±2.417 μg/mL，桑果酒中没有检测到C3G。

2.1.6 木犀草苷含量测定结果 木犀草苷的保留时间是5.160 1 min（图2），测得桑果原汁和桑果酒中木犀草苷的含量分别为（6.750±0.706）、（1.061±0.205）μg/mL。

2.1.7 硒含量测定结果 硒标准曲线的回归方程为y=147.26x+41.603，R2=0.999 8，测得桑果原汁中硒含量为（2.221±0.034）μg/L，桑果酒中硒含量为（2.246±0.118）μg/L，二者间差异不显著（P=0.881 9）。两个样品硒含量均未达到国家富硒食品质量标准规定（≥ 10 μg/L）。

2.2 桑果原汁和桑果酒抗氧化活性

2.2.1 羟自由基清除率 羟自由基清除率是样品抗氧化能力的重要指标之一，测得桑果原汁羟自由基清 除 率 为（6.533±1.260）% ，桑 果 酒 为（11.030±0.321）%，二者差异显著（P=0.014 4）。

2.2.2 对铁离子的还原能力 FeSO4标准曲线回归方程为y=0.422 1x-0.004 8，R2=0.997 9，桑果原汁和桑果酒对铁离子的还原力分别为（2 363.696±129.319）、（108.614±4.789）U/mL，二者差异极显著（P=0.001 0）。

3 小结与讨论

桑葚鲜果含有大量的水分（80%~85%），不能保存，进行干制、酿酒或进行活性成分提取［14］是目前桑葚储存和利用的主要出路。试验对桑葚直接榨汁和酿造果酒的功能成分和抗氧化活性进行研究，发现桑果原汁的总酚、原花青素、类黄酮、绿原酸、木犀草苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G）等成分的含量均显著高于桑果酒，二者的硒含量无显著差异。这可能与桑果原汁直接来自桑葚，未经过任何加工，能够较好保存桑葚有效成分有关。

进一步测定显示，桑果原汁对铁离子还原能力显著优于桑果酒，而桑果酒对羟自由基的清除率优于桑果原汁。羟自由基具有强氧化能力，可作用于体内蛋白质、核酸等生物分子，使细胞结构、功能受损，体内代谢紊乱，引起疾病。桑果酒的羟自由基清除率更高，说明桑果酒也是一种具有很好发展前景的健康产品。由于试验所测指标多依据桑葚成分确定，且仅对成酒前后进行了比较，而桑果酒酿造过程中的真菌发酵产生的次级代谢产物、动力学变化及其对桑果酒保健功能的作用有待于进一步的研究。