申嗪霉素-缬氨酸耦合物在小麦植株上的传导性研究

董 倩 ，赵炽娜 ，李俊凯 ，b

（长江大学，a.农学院；b.农药研究所，湖北 荆州 434025）

杀菌剂在植物病害防治过程中发挥了重要作用，特别是内吸性杀菌剂的出现对植物维管束病害和根部病害的防治发挥了至关重要的作用。内吸性杀菌剂的使用可以减少农药残留量，减少环境污染，并在一定程度上增强药效［1，2］。但目前国内外研制的大多数内吸性杀菌剂只能在植物质外体移动，如苯并咪唑类、哌嗪类等杀菌剂都只能通过根部吸收在植物体内从下往上运输，而无法通过叶面喷施来防治根部和维管束病害［3］。如果杀菌剂能通过茎叶喷雾后，经植物韧皮部向下传导来防治维管束病害和根部病害，不仅能有效防治此类病害，而且可以大大减少农药用量，降低劳动成本，减轻环境污染，但截至目前能通过韧皮部向下传导的杀菌剂数量相当有限。因此，研究和开发能通过植物韧皮部传导的新型内吸性杀菌剂对提高农药使用效率具有重要意义。

为了改善杀菌剂在植物韧皮部的传导性，李俊凯等［4］将在植物体内具有向基性传导的吲哚乙酸与不能向基性传导的化学杀菌剂三唑醇化合后施用于大豆植株的叶片，发现该化合物能向基传导至植株的根部。和拌种灵相比，拌种灵-丙氨酸耦合物能更迅速进入悬浮培养的大豆细胞，说明丙氨酸官能团可能会引导该衍生物通过主动吸收的方式进入植物细胞［5］。另外，以韧皮部传导的水杨酸与杀菌剂拼接后还具有增效的作用［6］。2019 年，Xiong 等［7］在申嗪霉素-氨基酸耦合物的氨基酸氮原子上引入不同取代基，发现所得到的化合物一定程度上保留了其传导性；另一方面，保留申嗪霉素分子结构中的羧基，而在申嗪霉素吩嗪环的7 号位引入氨基酸官能团，显著增加了这些化合物在韧皮部的传导性，暗示了氨基酸与申嗪霉素耦合物的传导性与耦合位点具有十分重要的关系［7］。这些研究都说明了氨基酸引入到杀菌剂分子中后能一定程度上介导杀菌剂在植物韧皮部的传导。申嗪霉素作为一种新型微生物源杀菌剂，主要用于防治水稻纹枯病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病和辣椒疫病等多种植物病害，具有高效、低毒及环境相容性好的特点，但是不具备韧皮部输导性，导致其使用方法和应用范围有一定局限性［8-10］。在前期研究中，笔者所在研究团队为了改善其韧皮部输导性，将其与氨基酸进行耦合，得到了一系列的申嗪霉素-氨基酸耦合物，利用蓖麻幼苗模式植物进行室内传导试验，发现申嗪霉素-L-缬氨酸在众多氨基酸耦合物中具有较优的韧皮部输导性，且具有一定的杀菌活性［11］。但这种化合物在成熟作物上的传导性和系统分布尚需进一步深入研究。本研究以申嗪霉素-缬氨酸耦合物为供试药剂，以单子叶作物小麦（Triticum aestivumL.）为供试作物，深入研究其是否有由主茎向分蘖间传导的特性及其在整株间的分布特性，以期为进一步探索氨基酸介导下农药在作物中内吸传导及韧皮部传导的新型杀菌剂的研究与开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 供试小麦为郑麦9023（生长期：分蘖期），由河南省农业科学院小麦研究所提供。供试药剂有申嗪霉素原药（PCA，含量99.9%），由上海交通大学提供；申嗪霉素-L-缬氨酸耦合物（PCA-LVal）和申嗪霉素-D-缬氨酸耦合物（PCA-D-Val），由长江大学农药研究所合成并提供。

供试仪器主要有Thermo UltiMate3000 TSQGuantis 超高效液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS型），美国赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scien⁃tific）；双光束紫外可见分光光度计（TU-1901 型），北京普析通用仪器有限公司。

1.1.2 药液配制 准确称取一定量的PCA、PCA-LVal 和 PCA-D-Val 于 10 mL 容量瓶中，加入 1 mL 二甲基亚砜（DMSO）超声溶解，添加2 滴渗透剂T、3 滴丙三醇和0.1% 的吐温80 于容量瓶内，混合均匀后用去离子水稀释至一定体积，使得最终药剂浓度为200 μmol/L，待用。

1.2 试验方法

1.2.1 供试植物药剂处理方法 每盆塑料盆钵装有基质及沙土（体积比3∶1），小麦催芽后，种植在塑料盆钵中，平均每盆播种20 颗，播种后浇水使土壤彻底湿润。将塑料盆钵置于温室环境下培养，待小麦长至分蘖期时，用柔软的毛笔在小麦主茎的所有叶片上分别均匀涂布200 μmol/L 的3 种供试药剂，并设置清水对照，各处理重复3 次。

1.2.2 采样处理 小麦分蘖期的取样部位为主茎叶片、分蘖叶片、根部，取样时间为处理后3、9、18、30、48 h。

1.2.3 小麦植株样品的前处理方法 准确称取小麦叶片样品3.00 g，置于150 mL 磨口三角瓶中，加入50 mL 甲醇，于研钵中充分研磨，超声提取30 min，抽滤，用甲醇分别超声提取2 次，合并滤液；滤液过无水硫酸钠漏斗除水后，旋转浓缩至近干，待净化。将浓缩提取液用少许二氯甲烷转移至250 mL 分液漏斗中，加入50 mL 10%的氯化钠水溶液和5 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液，混匀后用二氯甲烷分2 次振荡萃取；弃去二氯甲烷相，碱性水相用冰乙酸调节pH 至弱酸性，再用二氯甲烷振荡萃取3 次，静置至完全分层，收集二氯甲烷相，合并滤液，经无水硫酸钠除水后，于旋转蒸发仪上蒸干，用色谱甲醇溶解，使用氮吹仪定容至1.00 mL，过0.22 μm 滤膜，待测。

1.2.4 液相色谱与质谱条件 色谱条件：色谱柱为Hypersil-Gold-C18（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）。梯度洗脱程序为0~2.0 min，95%A；2.0~6.0 min，95%~2%A；6.0~8.0 min，2% A；8.1~10.0 min，2%~95% A；流速为0.3 mL/min；进样量10 μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测。电喷雾电压为3 500 V；离子化温度为350 ℃；毛细管温度为400 ℃，雾化气和气帘气均为高纯氮气；碰撞气为氩气，碰撞气压力为0.2 Pa；鞘气流速为30 L/min；辅助气流速为5.0 L/min；PCA定量离子对225.1/207.0，碰撞能量26 V；定性离子对225.1/152.0，碰撞能量45 V。PCA-L-Val和PCA-D-Val选择m/z324.1/207.0 作为定量离子对、m/z324.1/278.1作为定性离子对，碰撞能量45 V。

1.2.5 标准溶液的配制与标准曲线的绘制 准确称取 PCA 纯品 0.004 5 g、PCA-L-Val 和 PCA-D-Val 纯品0.006 5 g，移至容量瓶中，用甲醇溶解定容至100 mL，摇匀，配制成200 μmol/L 标准溶液。将标准溶液用色谱甲醇稀释配制0.031、0.310、1.500、3.000、6.000、15.000、25.000 μmol/L 的系列标准溶液，在选定的LC-MS/MS 检测条件下测定。提取供试化合物的定量离子，以该定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，相应PCA、PCA-L-Val 和 PCA-D-Val 的浓度（X，mg/L）为横坐标绘制标准曲线，计算出相应的标准曲线方程式及相关系数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及添加回收率

申嗪霉素及其缬氨酸耦合物质谱与色谱结果分别如图1、图2、图3 所示，添加回收率结果如表1 所示。结果表明，标准溶液中供试药剂在选定的浓度范围内与检测峰面积呈线性关系，得到PCA 标准溶液的回归线性方程式为y=2×106x-1 501.5，相关系数为0.999 9；PCA-L-Val 标准溶液的回归线性方程式为y=1×106x-34 786，相关系数为0.999 6；PCAD-Val 标准溶液的回归线性方程式为y=2×106x-21 363，相关系数为0.999 7。以上结果表明，申嗪霉素-缬氨酸耦合物标准溶液与其相对应的色谱峰面积选定的质量浓度范围内线性关系良好，符合农药残留定量分析的标准。

表1 供试化合物在小麦叶、茎、根部基质中的添加回收率及相对标准偏差（n=5）

在0.150、1.500、3.000 μmol/L 3 个添加水平下进行添加回收试验，结果（表1）表明，PCA 的平均回收率范围为83.24%~89.72%，RSD（相对标准偏差）范围为1.81%~4.97%；PCA-L-Val 的平均回收率范围为 89.92%~94.21%，RSD范 围 为 2.11%~11.51%；PCA-D-Val 的平均回收率范围为89.25%~93.63%，RSD范围为1.21%~5.18%。这表明该检测方法可行，符合农药残留分析的要求。

2.2 供试化合物在分蘖期小麦植株中各部位的含量分布

使用浓度为200 μmol/L 的药液叶面处理小麦主茎叶片后，采用LC-MS/MS 检测小麦植株鲜样中各部位供试化合物的含量，结果如表2 所示。结果表明，使用申嗪霉素-缬氨酸耦合物处理小麦主茎叶片后，在植株根部可检测到相应化合物存在，而申嗪霉素处理小麦主茎叶片后在植株根部未检测到其存在，说明申嗪霉素-缬氨酸耦合物具有在小麦植株韧皮部传导的特性；其中，药剂处理后3~48 h，PCAL-Val 在小麦根部中的含量随着时间推移呈先增加后减少的趋势，且在18 h 达到最大值，为15.50 μmol/kg，PCA-D-Val 也表现出同样的变化趋势，且在同一时刻达到最大值，为11.37 μmol/kg；总体而言，PCA-L-Val 在分蘖期小麦植株中的韧皮部传导性强于PCA-D-Val。同时在小麦的分蘖叶片中也检测到供试化合物的含量，但是经申嗪霉素处理小麦后在该植株分蘖叶片中未检测到其含量，说明申嗪霉素-缬氨酸耦合物还具备了由主茎向分蘖间传导的特性；其中，PCA-L-Val 叶面处理小麦3 h 后该化合物在分蘖中的含量达到最大值，为8.74 μmol/kg，而PCA-D-Val 在同一时刻也达到最大值，为4.54 μmol/kg，且二者随着时间推移在小麦分蘖中的含量总体呈下降趋势。以上结果表明，PCA-L-Val 在小麦上的这种传导特性强于PCA-D-Val。

表2 不同时间下供试化合物处理分蘖期小麦后植株鲜样中各部位含量

3 小结与讨论

本研究结果表明，申嗪霉素-缬氨酸耦合物具有在小麦韧皮部传导的特性，分蘖期小麦植株根部检测到目标化合物含量最高可达15.50 μmol/kg，并且处理时间为3 h 时根部申嗪霉素-L-缬氨酸的检测量与处理时间为48 h 时的检测量接近，说明其能在根部稳定积累。更重要的是，还发现该耦合物在小麦分蘖期有从主茎向分蘖间传导的特性，小麦植株分蘖中的缬氨酸耦合物含量最高可达8.74 μmol/kg。由此可知，与不具备韧皮部传导性的申嗪霉素相比，缬氨酸的引入赋予了耦合物在小麦植株体内向下的传导性，而且还具有从主茎向分蘖传导的特性，此结果对开发具有植物韧皮部传导能力的新型杀菌剂意义重大。

对比同一处理浓度下2 种构型的申嗪霉素-缬氨酸耦合物在小麦体内的含量分布情况，申嗪霉素-L-缬氨酸耦合物在分蘖上和根部的含量都明显高于申嗪霉素-D-缬氨酸耦合物。D构型的缬氨酸耦合物在根部能检测到的最大含量为11.37 μmol/kg，而L 构型的缬氨酸耦合物在根部能检测到的最大含量为15.50 μmol/kg，说明L 构型缬氨酸的引入更有利于耦合物在小麦上内吸传导性的提高，这也与YU等［11］在蓖麻上的研究相符合。本研究再次证实了不同构型的氨基酸引入对活性母体在作物中的内吸传导性具有不同的影响。

在此前的研究中利用申嗪霉素-L-丙氨酸酯及其水解产物申嗪霉素-L-丙氨酸进行了蓖麻传导性试验，结果表明，申嗪霉素-L-丙氨酸酯不具备韧皮部传导性，其水解产物申嗪霉素-L-丙氨酸却具有韧皮部传导性［12］。进一步分析认为，申嗪霉素-氨基酸酯类耦合物之所以不能传导，可能是因为氨基酸酯耦合物并不能被氨基酸运输载体所识别，将氨基酸羧基脱保护后则能够被相应的载体识别、运输并表现出在植物韧皮部优良的传导性［3］。关于氨基酸与农药耦合后形成的化合物在植物韧皮部中的传导是否利用了氨基酸转运载体的研究目前也有了一定的基础。氨基酸转运蛋白底物具有多样性，它们作用下的药物吸收在韧皮部的转运是一个精细的过程，涉及错综复杂的机制。其中，AAPs 家族转运蛋白对酸性和中性氨基酸转运能力一般［13］，但是AtA⁃AP6 蛋白则对中性氨基酸和谷氨酰胺具有较高的亲和力［14］；Ren 等［15］的研究表明，过表达拟南芥中的AtAAP1基因增加了根和原生质体对氯虫苯甲酰胺-丙氨酸耦合物的吸收。Jiang 等［16］的研究表明，氟虫腈-L-谷氨酰胺的摄取与氨基酸转运体AtLHT1的表达之间存在直接的相关性。Chen 等［17］的研究表明，缺乏AtLHT1基因的幼苗无论是对氯虫苯甲酰胺-甘氨酸耦合物的吸收还是从根到茎的转运都表现出减少的趋势。由于除了没有立体构型的甘氨酸外，高等植物中几乎所有的氨基酸都是L 型［18］。所以提出了以下推测：申嗪霉素-L 缬氨酸耦合物在小麦体内更容易被其相应的转运蛋白所识别，另一方面，L 构型的缬氨酸转运蛋白同样可以识别D 构型的缬氨酸，但识别能力较低。因此，可以解释在小麦体内检测到申嗪霉素-L-缬氨酸耦合物的含量比申嗪霉素-D-缬氨酸耦合物的含量高。但是究竟申嗪霉素-缬氨酸耦合物的传导性是否利用了小麦体内氨基酸转运载体进行传导，作为导向化合物的氨基酸种类和结构与耦合物的传导性之间存在何种关系，作为导向化合物的氨基酸种类与载体的类型之间存在何种关系，这些关键问题仍需要进一步解决。