PM2.5 通过增加海马神经炎症引起小鼠的认知障碍

付信靖张 钰郭建国张 玲秦 川

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021)

伴随着现代社会的工业化进程的加速,空气污染日益严重,已成为当代的一个全球化问题[1]。 空气污染物由若干种组分组成,其中包括细颗粒物(PM 2.5)、超细颗粒物(UFPM)、毒性气体、有机化合物和金属颗粒等,其重要来源是与交通相关的空气污染物,主要是柴油机废气(DE)[2]。 细颗粒物又称细粒、细颗粒、PM2.5(particulate matter 2.5,PM 2.5),指环境空气中空气动力学当量直径小于等于2.5 μm 的颗粒物。 它能较长时间悬浮于空气中,其在空气中含量浓度越高,就代表空气污染越严重。 随着研究进展,细颗粒物PM2.5 对人体健康的影响也日益凸显[3]。

PM2.5 对人体的危害首先表现在呼吸系统。除呼吸系统外,空气中的细颗粒物PM2.5 吸入后对其他器官和系统产生负面作用,如心血管系统、生殖系统、神经系统和免疫系统等[4]。 大规模的流行病学研究发现,空气污染组分细颗粒物(PM)对人类认知功能产生负面影响。 近来公认的一种机制是PM2.5 可以直接损伤中枢神经系统,同时污染物引起呼吸系统和免疫系统产生有害因子,通过外周循环到达大脑,导致大脑的神经炎症和氧化应激等反应,损伤神经细胞的结构和功能。

本项目对PM2.5 呼吸暴露的病理生理机制理论进行更深层次的探索,探究空气中细颗粒物PM2.5 对小鼠认知功能的影响,及发生病理改变的分子机制。 有研究提示,PM2.5 暴露可导致小鼠产生认知症状,而具体机制尚不明确[5]。 本研究是宏观环境因素与微观分子机制相结合的机制探索研究,有助于加深环境因素、空气污染影响人体健康的具体分子机制的理解,为环境与健康的相关研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究选用8 周龄雌性C57BL/6 小鼠12 只,购于南京模式生物研究所[SCXK(苏)2018-0008],体重(21±2)g。 所有小鼠均为SPF 级,饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所、北京协和医学院比较医学中心南院屏障环境中[SYXK(京)-2018-009]。 环境温度24℃～26℃,光照14 h,黑暗10 h,小鼠均自由饮水取食。 本实验中动物的使用已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准(ILAS-QC-2017-002)。 本次实验所有的动物实验操作过程严格按照实验动物使用的3R 原则和伦理的相关规定进行。

1.2 主要试剂与仪器

狭缝分离式PM2.5 在线浓缩富集系统购自北京慧荣和科技有限公司；行为学设备为Ethovision XT 软件监测系统,购自荷兰Noldus 公司；HE 以及免疫组化染色试剂盒,购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Grp I Panel 23-plex 试剂盒购自美国Bio-Rad 公司；磷酸缓冲盐(PBS)购自美国Gibco 公司；Iba-1(货号ab178847)购自美国Abcam 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠的空气细颗粒物PM2.5 暴露模型的建立

本实验选取8 周龄C57BL/6 雌性小鼠共12只,随机分为2 组,每组6 只,分别进行含有高浓度的细颗粒物PM2.5 的空气暴露或对照组屏障环境内的清洁空气的暴露。 暴露时间为2018 年北京冬春季,于PM2.5 污染较严重时,将室外空气经PM2.5 在线浓缩富集系统进行实时收集、浓缩富集,细颗粒物富集至浓度100 ～800 μg/m3。 小鼠置于PM2.5 在线浓缩富集系统内自由活动,每日固定暴露4 h,每周暴露5 d,共持续15 周。

1.3.2 小鼠新物体识别实验

新物体识别实验(novel object recognition test)是一种评价认知功能的实验方法,主要被用于评价认知和短期记忆功能等。 实验箱为长50 cm、宽50cm、高30 cm 的区域,四周均不透明。 实验室保持安静,室内温度保持恒定,光线保持均匀。 每次每只小鼠实验前后均用75%乙醇喷洒、擦拭实验箱和实验用积木,防止每只动物之间气味干扰。

新物体识别实验过程共2 d,分为第1 天适应期(blank):动物对行为箱适应5 min,第2 天熟悉期(sample)和测试期(test),熟悉期将两块相同的红色圆柱体积木(直径3 cm)分别放在盒子内左右两侧,距离箱体侧壁8 cm,小鼠自由嗅探积木5 min。 1 h后为测试期:将箱内一个物体换成蓝色正方体积木(边长3 cm),位置不变,将小鼠放入箱内同一位置,记录小鼠在5 min 内对新旧两个不同实验积木的探索时间,即TN(time of new object)和TF(time of familiar object )。 实验结果以识别指数(discrimination index, DI)表示,计算公式为:DI=(TN-TF/TN+TF)×100%[6-7]。

1.3.3 病理学检测

将小鼠进行病理取材,各器官于福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,切取厚度为5 μm 的石蜡切片,常温保存并用于病理学检测,分别进行HE 染色或DAB 染色等。 随后用NanoZoomer Digital Pathology Image 软件获取图像,Image J 分析阳性区域面积和阳性斑块数目。

1.3.4 炎性多因子检测

炎性多因子检测是利用Luminex 悬浮芯片技术进行多个细胞炎性因子检测的方法,也称为液相芯片技术。 它是一种基于xMAP(flexible multi analyte profiling)技术的新型生物芯片技术平台,它在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体、酶底物、配体受体的结合反应及核酸杂交反应,通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的。 一个反应孔内可以完成多种不同的生物学反应。 本实验使用脑组织裂解液上清制备样品,经过样品孵育、 抗体显色等步骤, 通过Luminex200 检测取得数值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠的空气细颗粒物PM2.5 暴露模型验证

实验动物随机为2 组,各组n=6,分别命名为C57BL/6+PM2.5(eC57,后文简称为“暴露组”),C57BL/6+CONTROL(C57,后文简称为“对照组”)。各组小鼠造模成功后,检测行为学症状、病理学表征、以及相关分子机制研究(图1)。

为了验证PM2. 5 暴露或清洁空气暴露是否可以引起小鼠肺的病理变化,我们对各组小鼠进行了肺取材和病理检测。 小鼠肺HE 染色发现,吸入PM2. 5 空气后,暴露组小鼠与清洁空气对照组相比,肺可见明显的病理结构改变,肺泡结构破坏,肺泡间隔增宽,大量炎性细胞局部浸润(图2)。 结果提示,PM2. 5 的暴露浓度和时长适量,成功建立了小鼠的PM2. 5 暴露模型,引起了肺部病变。

2.2 小鼠空气细颗粒物PM2.5 暴露后工作记忆能力下降

为了检测小鼠进行PM2.5 空气暴露后,是否出现认知行为改变,我们进行了小鼠的认知能力检测,以新物体识别实验检测小鼠的认知能力和工作记忆能力,暴露后进行行为学实验时小鼠大约为6月龄。 结果表明,C57 小鼠PM2.5 暴露后出现明显的工作记忆能力下降(图3)。 新物体识别实验利用小鼠对新物体的天然偏好, 以鉴别指数(dscrimination index)为指标,检测小鼠的工作记忆,若认知和短期记忆能力受损,则无法区分实验中哪个物块为新物体,结果表现为暴露组小鼠出现新物体识别能力降低、鉴别指数降低。 对照组(37.93±3.143),暴露组(20.57±5.098),P=0.0159。

2.3 小鼠中枢神经系统出现小胶质细胞激活

为了进一步研究PM2.5 暴露导致小鼠认知受损的机制,我们对各组小鼠中枢神经系统小胶质细胞的激活状态进行了Iba-1 免疫组织化学染色。 结果显示C57BL/6 小鼠在PM2.5 暴露后出现了海马部位Iba-1 的表达增加,提示PM2.5 暴露后小鼠中枢神经系统小胶质细胞的激活(图4)。 对各组小鼠海马的Iba-1 表达进行统计分析,C57BL/6 小鼠在PM2.5 暴露后均出现Iba-1 表达的显著增加(图5),对照组(0.1533±0.01856),暴露组(0.5033±0.04096),P=0.0015。 这一结果提示,C57BL/6 小鼠暴露PM2.5 后的认知受损可能由神经系统局部炎症增加造成。

2.4 小鼠中枢系统海马炎症因子含量增加

为进一步确认各组小鼠进行空气暴露后是否出现炎症反应,我们对小鼠中枢神经系统取材进行炎症因子检测,采用炎性多因子检测芯片,测定脑组织样品的炎症因子浓度。 结果表明,暴露PM2.5后,小鼠中枢神经系统出现炎症因子IL-6 的增加(图6)。 对照组0.9467±0.08950,暴露组1.263±0.04807,P=0.0356。 这一结果与小胶质细胞结果一致,提示C57BL/6 小鼠暴露PM2.5 后的认知受损可能由神经系统局部炎症增加造成。

注:小鼠分组进行空气暴露后依次进行行为学检测、病理取材,分别进行病理学检测、分子生物学检测等。图1 实验流程示意图Note. After air exposure, the mice in each group were subjected to behavioral tests, pathological sampling, pathological tests and molecular biological tests, respectively.Figure 1 Schematic diagram of experimental design

注:在新物体识别实验中,暴露组较对照组小鼠的新物体识别指数显著降低,即暴露组小鼠探索新物体的时间显著缩短。 对照组与暴露组相比,*P＜0.05。图3 新物体识别实验各组小鼠暴露后认知能力下降(n=6)Note. In the new object recognition experiment,the discrimination index of PM2.5 group was significantly lower than that in the Control group. The time of mice’ s exploring new object in exposure group was significantly shortened. Control group compared with PM2.5 group, *P＜0.05.Figure 3 Cognitive decline in new object recognition experiment after PM2.5 exposure

2.5 PM2.5 暴露未造成小鼠其他主要脏器损伤

为了排除PM2.5 暴露模型对小鼠认知功能产生影响不是由其他组织器官的病理损伤引起,我们对各组动物主要脏器进行病理学切片检测。 结果表明,PM2.5 暴露对小鼠肝、心脏、肾和大脑的组织结构均未造成明显病理损伤。 提示PM2.5 对认知的调控作用并非由其他组织器官损伤造成(图7)。

注:小鼠肺HE 染色结果表明,PM2.5 暴露组小鼠与对照组相比可见肺泡隔增宽,炎性细胞浸润,提示肺部病理改变,PM2.5暴露小鼠造模成功。图2 造模后小鼠出现肺部的病理改变Note. The results of lung HE staining in mice showed that compared with the control group, alveolar septal were broaden and inflammatory cells were infiltrated in the PM2.5 group, suggesting significant pathological changes in lung. Model of PM2.5 exposure mice was successfully built up.Figure 2 Pulmonary pathological changes in mice after modeling

注:各组小鼠海马Iba-1 免疫组化染色可见PM2.5 暴露组小鼠的中枢神经系统海马脑区出现Iba1 表达增加,小胶质细胞激活。图4 PM2.5 暴露增加小鼠海马小胶质细胞激活(n=3)Note. Immunohistochemical staining in the hippocampus of mice in each group showed increased Iba-1 expression (microglia activation) in the hippocampus of the central nervous system after PM2.5 exposure.Figure 4 PM2.5 exposure increased the activation of hippocampal microglia cells in mice

3 讨论

目前已有多项研究证实,空气污染与多种类型的认知功能呈负相关关系[8]。 已有报道PM2.5 暴露后,PM2.5 颗粒上附着的金属颗粒可对机体造成持续性伤害,在包括脑组织的众多组织中均发现了金属颗粒沉积[9]。 越来越多证据提示暴露在金属颗粒中,可对生长期的动物产生神经毒害作用,并可导致神经炎症[10]。 我们采用的PM2.5 浓缩富集系统可保留大气中PM2.5 颗粒上附着的有害物质,真实地模拟动物在高浓度PM2.5 天气下暴露状态。 通过高浓度PM2.5 暴露小鼠15 周,实验结束后我们发现暴露后的小鼠肺泡隔增宽、炎性细胞浸润,表明小鼠PM2.5暴露模型建立成功,为后续研究创造了基础。

注:对各组小鼠海马区域Iba-1 表达进行统计分析,结果表明,暴露组与对照组相比出现海马脑区明显的Iba-1 表达增加。 对照组与暴露组相比,**P＜0.005。图5 PM2.5 暴露导致小鼠海马Iba-1 表达增加(n=3)Note. Statistical analysis of Iba-1 expression in the hippocampal region of mice in each group showed that the PM2.5 group had significantly increased Iba-1 expression in the hippocampal region compared with the control group. Control group compared with PM2.5 group, **P＜0.005.Figure 5 Increased expression of Iba-1 in hippocampus of mice caused by PM2.5 exposure

注:对各组小鼠中枢神经系统样品的IL-6 含量进行统计分析,结果表明,暴露组与对照组相比出现中枢神经系统明显的IL-6 含量增加。 对照组与暴露组相比,P＜0.05。图6 PM2.5 暴露导致脑内炎症因子IL-6 含量增加(n=3)Note. Statistical analysis of IL-6 expression in mice brain in each group showed that the PM2.5 group had significantly increased IL-6 expression in mice brain. Control group compared with PM2.5 group,*P＜0.05.Figure 6 Increased expression of IL-6 in mice brain caused by PM2.5 exposure

注:对小鼠除肺外的其他主要脏器进行HE 染色和病理学分析,结果表明各组小鼠肝、心脏、肾以及大脑组织,细胞形态和结构规则、完整,提示各个重要组织器官病理学未见明显异常。图7 各组小鼠PM2.5 暴露后肝、心脏、肾及大脑组织未见异常(n=3)Note. HE staining and pathological analysis were carried out on other major organs of mice. The results showed that the morphology and structure of liver, heart, kidney and brain tissues of mice in each group were regular and complete, suggesting no obvious pathological abnormalities in each important tissue and organ.Figure 7 No pathological abnormalities were observed in the liver, heart, kidney and brain tissues of mice exposed to PM2.5

PM2.5 影响中枢神经系统的机制可能是由于PM2.5 活化小胶质细胞,产生神经炎症,从而损伤神经元和突触功能[11]。 PM2.5 通过鼻部嗅球粘膜迁移或经摄取后进入循环系统的迁移,已通过工业纳米颗粒在啮齿类实验动物的实验研究中得以证实[12]。 啮齿类动物暴露于高浓度PM2.5 和柴油发动机尾气中,大脑中观察到了严重的炎症反应[13]。小胶质细胞暴露于PM2.5 后出现形态变化,表明小胶质可能参与PM2.5 诱导的神经元损伤[14]。 体外实验表明,PM2.5 以剂量依赖方式的降低神经元细胞生存率,导致小胶质细胞活化和神经元损伤[15]。此外,经PM2.5 刺激的小胶质细胞可释放更多的促炎性细胞因子,如IL-1β 和TNF-α[16]。 而TNF-α 作为一种关键的促炎性细胞因子,已被认为可导致轴突变性,影响神经突触的形成[17]。 也有研究证明,PM2.5 暴露诱导的小胶质细胞激活可被吡格列酮等抗炎药抑制[18]。 这表示小胶质细胞在作为PM2.5 诱导神经炎症的中介上起到了关键作用。在我们的实验中,对中枢神经系统海马的小胶质细胞进行免疫组织化学染色和分析,也发现小鼠可出现中枢神经系统的小胶质细胞激活,诱发了神经炎症状态。

综上所述,本研究对小鼠成功建立了PM2.5 暴露模型,结合动物行为学、病理学、分子生物学等方法,初步探究了空气细颗粒物PM2.5 引起小鼠的认知症状的神经炎症机制,为后续的PM2.5 对健康的危害研究提供参考。