HPLC测定天麻祛风补片中天麻素、哈巴苷和梓醇的含量

杜健磊, 张彦旭,王俊苹

（1.驻马店市中心医院 药学部，河南 驻马店 463000；2.驻马店市第二人民医院 药学部，河南 驻马店 463000）

天麻祛风补片具有温肾养肝、祛风止痛等功效，临床常用于治疗肝肾亏损、风湿入络所致的痹病，如头晕耳鸣、关节疼痛、腰膝痠软、畏寒肢冷、手足麻木等症的治疗[1-4]。该品种系由天麻、地黄、当归、羌活、独活、附片、肉桂、杜仲、川牛膝、玄参等11味药材加工制成，方中天麻为君药，具有息风止痉，平抑肝阳，祛风通络之功效[5-8]，地黄为臣药，具有淸热凉血，养阴生津之功效[9-12]，玄参为佐药，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结之功效[13-16]。该品种现收载于2015版《中国药典》中，标准中含量测定项为天麻素，仅针对君药天麻进行质量控制[17]。为保障人民群众的用药安全，本研究建立天麻祛风补片中天麻素、哈巴苷和梓醇含量测定的高效液相色谱（HPLC）分析方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-2010 AHT型高效液相色谱仪（在线脱气机、四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器、LC-Solution工作站，岛津科技有限公司）；Sartorius Quintix513-1CN型万分之一电子天平（赛多利斯科技有限公司）；Fuyang F-040S型小型超声仪（容积：10 L，苏州迈弘电器有限公司）。

1.2 试药

天麻素对照品（批号：110807-201809，含量以96.7 %计）；哈巴苷对照品（批号：111729-201707，含量以96.8 %计）；梓醇对照品（批号：110808-201711，含量以99.6 %计），均购于中国食品药品检定研究院；天麻祛风补片（昆明中药厂有限公司，规格：糖衣片，片心重0.35 g，批号：191012，191223，200116）；甲醇、乙腈均为色谱纯，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Spherisorb ODS-1 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，1 % A；8～13 min，1 %A～12 % A；13～24 min，12 %A～48 % A；24～28 min，48 %A～82 %A；28～31 min，82 %A～1 % A；31～36 min，1 % A）；检测波长：216 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：10 µl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取梓醇对照品、天麻素对照品和哈巴苷对照品适量，精密称定，置50 ml量瓶中，加80 %甲醇制成每1 ml含梓醇0.996 mg、天麻素0.484 mg和哈巴苷0.581 mg的对照品储备溶液；再精密量取2.5 ml，置25 ml量瓶中，加80 %甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取天麻祛风补片（批号：191012）20片，除去包衣，精密称定，研细，取约2.0 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加80 %甲醇约30 ml，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）25 min，取出放冷至室温，加80 %甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 µm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按天麻祛风补片处方比例及制备工艺，制备缺地黄、天麻和玄参的阴性对照样品，阴性对照样品按供试品溶液制备方法处理，制得阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取2.2项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 µl，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，采集色谱图。结果发现供试品溶液色谱图中梓醇、天麻素和哈巴苷色谱峰保留时间与对照品溶液一致，且3种活性成分分离良好，阴性对照溶液色谱图无干扰峰存在，表明方法专属性良好。见图1

图1 典型色谱图

2.3.2 精密度考察 取2.2.1项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件，重复进样6次，每次进样10 µl，采集色谱图，依据6次进样所得色谱图中梓醇、天麻素和哈巴苷峰面积计算RSD。结果梓醇峰面积RSD为1.12 %，天麻素峰面积RSD为0.91 %，哈巴苷峰面积RSD为0.78 %，表明仪器精密度良好。

2.3.3 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下对照品储备溶液适量，加80 %甲醇制备含梓醇、天麻素和哈巴苷系列标准曲线溶液，上述溶液分别精密吸取10µl，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，采集色谱图。分别以梓醇、天麻素和哈巴苷峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，计算曲线方程。结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.3.4 重复性试验 取同一批号天麻祛风补片（批号：191012）共6份，按2.2.2项下制备供试品溶液，分别精密吸取上述溶液各10 µl，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，采集色谱图。分别计算梓醇、天麻素和哈巴苷含量，以6次含量测定结果计算RSD。结果梓醇、天麻素和哈巴苷平均含量分别为0.4167，0.1936，0.5021 mg/片；重复性RSD分别为2.01 %，2.37 %，1.63 %，表明方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取2.3.4项下供试品溶液，于室温下分别放置0，2，4，6，9，12，24 h，各精密吸取10 µl，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，采集色谱图。结果梓醇峰面积的RSD为1.72 %，天麻素峰面积RSD为2.11 %，哈巴苷峰面积RSD为1.16 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已测定梓醇、天麻素和哈巴苷含量的天麻祛风补片（批号：191012）共6份，每份约2.0 g，精密称定，置50 ml量瓶中，精密加入2.2.1项下对照品储备溶液适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液；分别精密吸取上述溶液各10 µl，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，采集色谱图；计算梓醇、天麻素和哈巴苷的加标回收率。见表2。

表2 加标回收试验结果

2.4 样品测定

取天麻祛风补片（昆明中药厂有限公司，批号：191012，191223，200116），分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取上述溶液各10 µl，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，采集色谱图，计算样品中梓醇、天麻素和哈巴苷的含量。见表3。

表3 含量测定结果

3 讨论

3.1 活性成分的选择

天麻祛风补片是由天麻、地黄、玄参、当归、羌活等11味药材经打粉、混合、煎煮等工序加工制成的中药片剂，现行标准中以天麻药材中天麻素为含量测定项，不能较全面地体现该产品的质量水平。本文选择药材组成中君药天麻、臣药地黄、佐药玄参，与其相对应的活性成分为天麻素、梓醇、哈巴苷，采用HPLC同时检测3种活性成分的含量，能更为全面地体现该品种的质量水平。

3.2 检测波长的选择

取2.2.1项下对照品溶液，精密吸取10 µl，按2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，设置光谱采集波长在200～400 nm范围，采集光谱图（见图2）。由光谱图可见，梓醇在210 nm、天麻素在219 nm、哈巴苷在210 nm处有最大吸收，综合3种活性成分的紫外响应，最终确定216 nm作为检测波长。

图2 3种成分紫外光谱图

3.3 提取方法的优化

分别选择甲醇、90 %甲醇、80 %甲醇和70 %甲醇作为提取溶剂，考察溶剂对提取效果的影响。结果选择80 %甲醇作为提取剂时，提取效果最佳；再分别考察超声功率和提取时间的影响，最终确定最佳提取条件为：80 %甲醇作为提取溶剂，超声功率250 W，时间25 min。

综上，本文建立天麻祛风补片中天麻素、哈巴苷和梓醇活性成分含量测定的HPLC分析方法，该方法具有简单、准确、重复性好等优点，可作为天麻祛风补片的定量检测方法，为进一步完善和提高该品种的质量标准奠定了基础。