超高效液相色谱-波长切换法同时测定健脾丸（浓缩丸）中4种成分的含量

郑 昆，伦志彩，罗兆亮

（1.日照市中医医院，山东 日照 276800；2.莒县中医医院，山东 莒县 276599；3.临沂莱博医药技术有限公司，山东 临沂 276017）

健脾丸（浓缩丸）是由党参、炒白术、陈皮、枳实（炒）、炒山楂和炒麦芽六味中药组成的中药制剂，其功能主治为健脾开胃，用于脾胃虚弱，脘腹胀满，食少便溏[1]。其中党参具有健脾益肺，养血生津作用[2]；炒白术具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎作用[2]。陈皮和枳实具有理气健脾，破气消积，化痰散痞作用。健脾丸是临床常用的中药制剂，其浓缩丸质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册。经查阅相关文献[3-4]，均以陈皮和枳实中共同存在的橙皮苷和柚皮苷等指标成分的含量测定对健脾丸进行质量控制[5-8]。目前，现有文献中缺少对处方中党参和白术的质量控制方法。超高效液相色谱技术（UPLC）与传统高效液相色谱（HPLC）相比，具有分析速度快、灵敏度高、节约流动相等优点[9-11]，尤其是对多组分样品进行分析时，可显著提高分析效率。本文以党参和白术中4种特有成分党参炔苷（党参）、白术内酯I、II、III（白术）作为指标成分，采用UPLC技术，建立含量测定分析方法，对健脾丸中的党参和白术进行质量分析，从而控制健脾丸的质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1290型超高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱（美国Agilent公司）；Meteler XP205型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-600DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；A10型超纯水机[密理博（中国）有限公司]。

1.2 试药

党参炔苷对照品（批号：111732-201908，纯度100 %），白术内酯I对照品（批号：111975-201501，纯度99.9 %），白术内酯II对照品（批号：111976-201501，纯度99.9 %），白术内酯III对照品（批号：111978-201501，纯度99.9 %，中国食品药品检定研究院）；健脾丸（规格：浓缩丸，每8丸相当于原生药3 g，批号：191104，19110202，191004，仲景宛西制药股份有限公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸（色谱纯），超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Poroshell 120 SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流速为0.5 ml/min；检测波长为270 nm（0～13.5 min，检测党参炔苷和白术内酯III）和220 nm（13.5～25 min，检测白术内酯I和白术内酯II）；柱温为30 ℃；进样量为5 μl；流动相为乙腈（A）-0.1 %乙酸（B），梯度洗脱：0～9 min，20 %A～50 %A；9～16 min，50 %A～55 %A；16～25 min，55 %A～100 %A。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取本品，研碎，精密称取约2.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，称定重量，加热回流提取1 h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取党参炔苷照品101.57 mg，白术内酯I对照品16.43 mg，白术内酯II对照品10.67 mg，白术内酯III对照品18.61 mg，分别置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各对照品储备溶液；分别精密量取各对照品储备溶液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册中收载健脾丸（浓缩丸）的处方制法，分别制备不含党参与不含白术的阴性样品，然后按供试品溶液的制备方法，分别制备缺少党参阴性样品溶液和缺少白术阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

分别取2.2项下对照品溶液、供试品溶液、缺党参阴性样品溶液与缺白术阴性样品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果各成分色谱峰峰形对称，分离度良好。在缺少党参阴性样品溶液和缺少白术阴性样品溶液色谱图中4种待测成分相应保留时间处没有其他色谱峰，说明不存在其他成分的干扰。

图1 专属性试验HPLC图谱

2.4 线性关系试验

取2.2.2项下对照品储备溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 ml，分别置100 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得各对照品标准系列溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以各对照品溶液的浓度（x，μg/ml）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，制备标准曲线方程。标准曲线方程和相关系数（r）结果见表1。

表1 4种待测成分回归方程及线性范围

2.5 精密度试验

精密量取2.2.2项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，连续测定6次，记录4种待测成分峰面积的RSD分别为1.17 %，1.04 %，1.28 %和1.05 %，表明方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取本品（批号：191104），按2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h进样，记录4种待测成分色谱峰面积。结果4种成分峰面积的RSD分别为1.33 %，1.42 %，1.26 %，1.34 %，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取本品（批号：191104），按2.2.1项下方法制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，记录各成分色谱峰面积并按照标准曲线法计算其含量。结果，4种成分含量的RSD（n=6）分别为1.52 %，1.35 %，1.67 %，1.82 %，表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取已知含量的样品（批号：191104），精密称取1.0 g，共6份，置锥形瓶中，分别精密加入4种待测成分对照品贮备溶液各0.5 ml，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算4种待测成分的回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 耐用性试验

取2.2项下供试品溶液，分别改变高效液相色谱仪（Agilent 1290和LC20A）、色谱柱型号[Poroshell 120 SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Accucore C18（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）]、柱温（30 ℃、40 ℃和室温）和流速（0.45，0.5，0.55 ml/min）等条件，考察其对检测结果的影响。结果表明，在上述范围内改变色谱条件，各色谱峰的分离度良好，表明本方法的耐用性良好。

2.10 样品测定

取健脾丸3批，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分的含量，结果见表3。不同批次产品的含量基本一致，说明本药在不同批次间的质量较为稳定。

表3 含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 流动相的选择

本试验比较了分别以甲醇-水与乙腈-水作为流动相的洗脱效果。选择甲醇-水作为流动相时，党参炔苷色谱峰与相邻色谱峰分离度较差，且白术内酯III色谱峰峰形较差，色谱系统的压力较高，对色谱柱不利。选择乙腈-水作为流动相时，色谱系统压力较低，有利于保护色谱柱，党参炔苷色谱峰与相邻色谱峰分离度较好，为了改善色谱峰的峰形，在水中加入0.1 %乙酸，此时各待测成分色谱峰峰形对称，因此，本试验选择乙腈-0.1 %乙酸溶液作为流动相。

3.2 检测波长的选择

本试验采用二极管阵列检测器，扫描4种待测成分的紫外吸收曲线（见图2），发现党参炔苷和白术内酯III在270 nm波长处具有较强紫外吸收，白术内酯I和白术内酯II在220 nm波长处具有较强紫外吸收，为了提高各成分的响应值，提高检测灵敏度，本文采用检测波长切换法，分别选择270 nm（0～13.5 min，检测党参炔苷和白术内酯Ⅲ）和220 nm（13.5～25 min，检测白术内酯I和白术内酯II）作为4种待测成分的检测波长。

图2 不同检测波长HPLC图谱

健脾丸（浓缩丸）是《卫生部药品标准》中收载的中成药制剂，该药在临床使用中用量较大，现行质量标准和已发表的文献仅对组方中陈皮和枳实进行质量控制，缺少对党参和白术的质量控制。本文采用UPLC，以党参和白术为研究对象，对党参和白术中4种成分进行含量测定，可有效控制该制剂中党参和白术的质量。本文研究方法重复性好，结果准确，可为健脾丸（浓缩丸）质量控制提供技术支撑。