研究PODXL 在肾透明细胞癌中的表达及相关意义

石磊 孙庭

（南昌大学第一附属医院 江西南昌330006）

从肾实质泌尿小管上皮细胞产生的恶性肿瘤称为肾癌，同时也称为肾细胞癌（RCC），RCC 占肾脏恶性肿瘤的85%～90%[1]， 而RCC 占成人恶性肿瘤的3.79%[2]。 RCC 的一种病理亚型肾透明细胞癌（ccRCC），占RCC 的75%[3]。 ccRCC 具有很高的转移性和侵袭性等特性，死亡率是肾癌病理亚型中最高的类型。相关研究表明有20%～30%的肾透明细胞癌患者在初次就诊时，已出现临床转移[4]。 在肾癌患者的治疗方法中，放疗及化疗对于治疗肾细胞癌的疗效均不理想， 手术切除目前是对局部进展性肾细胞癌和局限性肾细胞癌的主要治疗方法，但约30%的肾癌患者在术后出现复发和转移[5]。 有文献报道，美国2018 年约有65 340 例确诊为肾细胞癌的患者，约有10 010 例患者死于肾细胞癌，死亡病例数明显较前一年上升[6]。 晚期肾细胞癌治疗方法甚少，多以放化疗为主，且疗效及预后均不佳。寻找对诊断和治疗肾透明细胞癌有重要价值的生物标志物和治疗靶点具有一定的临床意义。 足细胞标志蛋白

（Podocalyxin-like Protein, PODXL）在染色体的位置位于7q32-q33 上，分子量大小为140～160 KD，属于CD34 家族成员之一，是唾液黏蛋白的一种类型，富含负电荷，属于高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，相关研究发现，PODXL 在肾小球足细胞、造血细胞、血管内皮细胞和乳腺上皮细胞中均有较高的表达[7～12]，PODXL 在一些肿瘤细胞中可向细胞膜突起， 并且能够在细胞胞浆中表达，但不能在细胞核中表达[13]。有关PODXL 在生理活动过程中的作用研究发现，PODXL 能够参与神经发育、调节血管通透性、白细胞-内皮细胞相互作用和造血等多种生理过程[14～17]。目前，PODXL 基因与肾癌疾病的关系在国内外尚未见报道， 本研究主要是通过癌症基因组图谱（TCGA）数据库（http://cancergenome.nih.gov/）分析PODXL 在ccRCC 的表达与临床病理学参数之间及患者预后等方面的相关性。 现报道如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料 从TCGA 数据库中TCGA KIRC Cohort（Kidney Clear Cell Carcinoma）中寻找下载转录组测序技术（RNA-Seq）数据，通过筛选，总共保留526 例ccRCC 样本， 其中包含72 例肿瘤组织及与其配对的癌旁正常组织。 根据肾癌美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer, AJCC）临床分期：Ⅰ期病例数265 例，Ⅱ期病例数54 例，Ⅲ期病例数126 例，Ⅳ期病例数78 例，未知病例数3例。 包括男342 例，女184 例。

1.2 从GEPIA 数据库引入数据 GEPIA 数据库（http://gepia.cancer-pku.cn）是由北京大学研究开发，总共包含了TCGA 和GTEx 项目的9 736 个肿瘤和8 587 个正常样品的核糖核酸（Ribonucleic Acid,RNA）测序表达数据，可用于在线分析基因在癌症和正常组织中差异表达的数据库，包括肾癌在内的共33 种恶性肿瘤[18]。 使用GEPIA 数据库分析PODXL 在ccRCC 组织以及正常肾脏组织中的表达程度的不同。

1.3 使用受试者工作特征曲线 （ROC） 进行分析引入ROC 曲线分析下载的ccRCC 患者样本数据共526 例与配对的癌旁正常组织72 例的PODXL mRNA 表达量，分析PODXL 表达量在诊断ccRCC中的灵敏度和特异度。比较分析526 例ccRCC 患者PODXL mRNA 表达量和相对应的临床特征的关系， 将数据样本按照PODXL mRNA 的标准化表达量进行由高到低的排序，将数据均分为两等分，前半部分为高表达组， 后半部分为低表达组。 采用Kaplan-Meier 生存曲线和Log-rank 生存曲线检验法两种方法，分析ccRCC 患者中PODXL mRNA 表达情况与患者生存预后的相关性。

1.4 统计方法 引入SPSS 23.0 软件对从数据库收集到的信息进行解读和分析， 患者临床病理学参数与癌组织中PODXL mRNA 表达量的关系及强度采用χ2检验进行分析，计量资料以（±s）表达，为比较ccRCC 和配对的癌旁正常组织中PODXL mRNA 表达量的不同采用配对t检验。 采用Kaplan-Meier 描绘生存曲线图，采用Log-rank 检验PODXL mRNA 表达量与患者生存状况的关系。 使用单因素和多因素回归分析PODXL mRNA 的表达量与患者临床病理学参数关系及预后的影响，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PODXL mRNA 表达在ccRCC 中的诊断价值ROC 曲线分析结果显示，PODXL mRNA 表达量对诊断ccRCC 具有潜在的诊断意义， 实验者的ROC曲线下面积药时曲线下面积（AUC） 为0.805，P=0.001，敏感性为67.26%，特异性为78.17%，95%CI为0.872～0.903。 见图1。

图1 PODXL mRNA 表达的ROC 曲线

2.2 GEPIA 分析PODXL mRNA 在癌旁组织中及ccRCC 组织中的差异 引用GEPIA 分析TCGA 来源的数据信息，包含ccRCC 组织526 例，其中包含72 例肾细胞癌旁正常组织。 PODXL mRNA 在ccRCC 组织中表达明显高于正常组织。 见图2。

图2 TCGA 数据库中PODXL mRNA 在ccRCC 组织与正常组织中的表达差异

2.3 ccRCC 组织中PODXL mRNA 的表达情况 数据库中526 例样本中ccRCC 组织和肾细胞癌旁正常组织中PODXL mRNA 表达差异很明显[ccRCC组织：（6.42±1.42），ccRCC 癌旁正常组织：（3.61±1.31），P＜0.001]。 其中配对的72 例样本中，ccRCC组织和配对癌旁正常组织中PODXL mRNA 表达差异也很明显[ccRCC 组织：（6.55±1.23），配对癌旁正常 组 织：（3.53±1.35），P＜0.001]。 说 明PODXL mRNA 在ccRCC 组织中的表达量明显比正常组织高。 见图3。

图3 ccRCC 组织中PODXL mRNA 的表达情况

2.4 PODXL mRNA 与ccRCC 患者临床病理学参数的关系 PODXL mRNA 表达量因性别、病理分级、临床分期、TNM 分期及远处转移不同均有差异（P＜0.001），与患者年龄、淋巴结转移、肿瘤所在位置等因素相关性不大（P＞0.05），可以认为有远处转移、高级别、 临床晚期及男性肾癌患者的PODXL mRNA 表达量较无转移、低级别、临床早期及女性肾癌患者高。 见表1。

表1 PODXL mRNA 表达与ccRCC 患者临床病理学参数的关系[例（%）]

2.5 ccRCC 患者生存预后与PODXL mRNA 表达的关系 ccRCC 患者的总生存期与PODXL mRNA表达量明显存在相关性， 表明PODXL mRNA 高表达组较低表达组的患者总体生存时间缩短明显，数据库526 例样本中PODXL 低表达组和高表达组的总生存时间分别（1 446.75±956.32）d 和（1 253.81±939.57）d，差异有统计学意义：Log-rank=13.98，P＜0.001。见图4。采用多因素和单因素回归模型分析数据库收集到的数据结果显示，PODXL mRNA 的表达不能作为独立预后指标： 单因素分析示HR=1.791，95%CI 为1.321～2.431，P＜0.001；多因素分析示HR=1.147，95%CI 为0.819～1.611，P=0.413。 该结果可能与样本量较少有关， 需增加样本数据进一步确定PODXL 的表达能否作为ccRCC 患者不良预后的独立预后指标，其中患者的年龄、病理分级、临床分期及是否存在远处转移等因素是能够作为ccRCC 患者独立预后指标的。 见表2。

图4 ccRCC 患者生存预后与PODXL mRNA 表达的关系

表2 单因素与多因素分析ccRCC 患者临床特征与患者生存预后关系

3 讨论

RCC 在泌尿系恶性肿瘤中的发病率位居第二，仅次于膀胱癌，且发病率呈逐年上升趋势，因肾脏解剖位置位于后腹膜，早期无明显特征性表现，极少出现腹部包块、 血尿、 腹痛等典型肾细胞癌临床三联征，当出现肾细胞癌三联征时，多表示该患者已进入肾细胞癌晚期。 对于早期患者可通过根治性手术切除治疗，晚期患者治疗手段少，放化疗效果及预后均较差。 相关文献研究表明20%～30%的ccRCC 患者确诊时已出现远处转移[4]。 寻找内分泌治疗靶点已成为肾癌治疗方法研究的一个新方向。

足细胞标志蛋白编码在染色体7q32-q33 上，研究发现PODXL 在肾小球足细胞、血管内皮细胞、造血细胞和乳腺上皮细胞中呈高表达状态[10～12]，PODXL 在一些肿瘤细胞的胞浆中表达， 但并不在细胞核中表达， 可向细胞膜突起[13]。 有文献报道，PODXL 参与神经发育、 白细胞-内皮细胞相互作用、调节血管通透性和造血等多种生理过程[14～17]。 目前也发现PODXL 在泌尿系统中各种癌症进展的有一定的临床意义， 首次发现是PODXL 在睾丸癌中作为干细胞标记物[8]。 后来Casey Graham 等[19]研究发现PODXL 在前列腺癌组织中呈高表达， 可能是前列腺癌侵袭性的候选基因之一。Heath Elisabeth I[20]等研究发现PODXL 在前列腺肿瘤组织中的表达量和H-评分明显升高， 使该蛋白成为前列腺癌可能的免疫组织化学标志物，这有助于对患者进行分级，从而获得最佳治疗。Boman K 等[21]研究发现PODXL的表达与肿瘤TNM 分期和高级别肿瘤显著相关，PODXL 可能是尿路上皮性膀胱癌患者疾病进展和死亡的独立危险因素。 另外PODXL 在其他系统癌症也存在一定的临床意义； 在消化系统方面，Borg David 等[22]研究发现PODXL 在食管癌和胃腺癌中的表达明显高于正常上皮细胞， 通过未校正COX回归分析证实，PODXL 在TTR 上的表达对预后有重要的意义，在校正模型中仍有显著意义，且与淋巴结转移和高级别肿瘤显著相关。Taniuchi Keisuke 等[23]使用免疫印迹法在胰腺癌细胞表面和培养上清液中均可检测到PODXL，PODXL 可能是一种新的、无创的胰腺癌诊断生物标志物。 然而，PODXL 基因与肾透明细胞癌疾病的关系目前在国内外尚未见报道， 故本研究通过检索TCGA 数据库信息， 探究PODXL 在ccRCC 的表达与临床病理学参数及患者预后的相关性。

结果显示， 数据库中526 例ccRCC 样本的PODXL 表达量比癌旁正常组织的表达量明显更高，差异具有统计学意义，同时本研究通过ROC 曲线法分析发现，PODXL 基因可作为一个灵敏度和特异度较高的ccRCC 诊断指标， 其中AUC 为0.805，敏感性为67.26%，特异性为78.17%。 生存时间分析发现， 总体526 例样本中PODXL 低表达者和高表达者的总体生存时间分别为（1 446.75±956.32）d 和（1 253.81±939.57）d，差异有统计学意义（Log-rank=13.98，P＜0.001）。 ccRCC 患者临床病理学参数与PODXL 基因表达情况的关系显示，PODXL 的表达因患者性别、 病理分级、TNM 分期、远处转移、 临床分期不同均有显著性差异，P＜0.001。 单因素和多因素回归模型分析结果发现，ccRCC 患者年龄、病理分级、临床分期及是否远处转移等可作为ccRCC 癌患者不良预后的独立危险因素，而PODXL 的表达量不能作为ccRCC 不良预后的独立危险因素（单因素分析示HR=1.791，95%CI 为1.321～2.431，P＜0.001； 多因素分析示HR=1.147，95%CI 为0.819～1.611，P=0.413），该结果可能与样本量较少有关， 如需证明PODXL 的表达量能否可以作为ccRCC 患者不良预后的独立危险因素，需增加样本量研究加以证实。

综上所述，通过挖掘公共数据库TCGA 并分析发现，PODXL 基因与ccRCC 中高表达与临床特征显著相关，其高表达对判断ccRCC 患者的生存预后及其诊断具有一定的参考价值。 为后续研究ccRCC抗肿瘤靶向治疗提供了新的研究方向，PODXL 有可能成为一个新的抗癌治疗靶点，可能改善ccRCC患者的预后。 虽然本研究已经初步证明PODXL 可能是一种新的ccRCC 诊断和预后标志物，但本研究也存在一些局限性， 所得结果均来自基因芯片数据库， 主要的缺点是TCGA 数据库只提供了PODXL在mRNA 水平上的表达， 这或许不能完全代表PODXL 在蛋白水平上的表达及活化程度。 目前PODXL 参与ccRCC 发生、发展的机制还不明确，也待于进一步研究。