CDK抑制剂(AT7519)对小鼠急性肝损伤的保护作用

刘彦君 黄鹤鸣 付荣 石翠翠 范建高 张元元 罗成 李光明

AT7519作为新型的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)抑制剂，可有效抑制CDK2、CDK5、CDK9的活性，促进中性粒细胞凋亡，并已在包括急性呼吸窘迫综合征在内等多种肺炎症模型中表现出了抗炎活性[1-3]。研究表明，氧化应激和炎症反应在肝损伤病理进程中起重要作用，抑制炎症反应或氧化应激可作为缓解急性肝损伤(acute liver injury, ALI)的潜在治疗方式[4,5]。因此，AT7519可能通过缓解炎症反应对肝损伤起保护作用。CCl4诱导的ALI模型现阶段被广泛应用于评估肝毒性和药物研发的相关实验研究中，CCl4可通过细胞色素P450尤其是CYP2E1，进行生物转化从而生成过氧化自由基，继而攻击肝细胞膜导致肝细胞坏死[6]。本研究旨在通过建立CCl4诱导的ALI模型，观察AT7519对肝损伤的保护作用，并对其作用机制进行初步探讨。

材料和方法

一、实验动物、实验药物与试剂

SPF级C57BL/6雄性小鼠30只，6～8周龄，体重19～21 g，由中国科学院上海药物研究所提供，标准动物饲料及饮水，饲养于12 h明暗交替环境下，适应1周后进行实验。所有动物实验均通过中国科学院上海药物研究所动物伦理委员会批准。

AT7519购自美国MedChemExpress公司；CCl4购自上海国药集团化学有限公司；橄榄油购自上海生工生物工程股份有限公司；LPS(E.Coli，菌株 O111:B4)购自美国Sigma公司。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin， HE)和F4/80、LY-6G免疫组化染色试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司。RNA提取、反转录试剂，以及RT-qPCR荧光染料试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

二、细胞培养及细胞炎症模型构建

小鼠巨噬细胞系RAW264.7来自中国科学院上海药物研究所，使用培养基为高糖DMEM+10%胎牛血清(Gibco澳洲胎牛血清)+1%双抗(链霉素、青霉素)，置于体积分数为0.05的CO2、37℃培养箱中生长。RAW264.7细胞以约1×106个细胞/mL的密度种于6孔板中，过夜贴壁后，分别以20 μmol、10 μmol、5 μmol不同浓度的AT7519预处理1 h后，再加入终浓度为1 μg/mL的LPS继续培养4 h收样。

三、实验动物与CCl4急性肝损伤模型的建立

将30只小鼠随机分成3组，正常对照组、模型组及药物干预组各10只。CCl4急性肝损伤模型通过单次腹腔注射10% CCl4(由橄榄油稀释)2 mL/kg诱导构建[7]。药物干预组接受AT7519 10 mg/kg腹腔注射2次，给药间隔24 h，第2次给药2 h后腹腔注射10% CCl4溶液。模型组给予等量0.9% NaCl溶液腹腔注射2次，间隔24 h，第2次注射2 h后腹腔注射10% CCl4溶液。正常对照组均接受等量0.9% NaCl溶液腹腔注射。在CCl4诱导刺激48 h后，用10%水合氯醛麻醉小鼠并取血及肝脏。

各组小鼠全血经4 ℃ 3 000 r/min离心15 min分离血清，保存于-80℃备用。部分肝组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋、切片；其余部分肝组织液氮速冻后保存于-80℃备用。

四、血清生化指标检测

使用Hitachi 7020全自动生化分析仪，检测血清ALT、AST。

五、肝组织染色

将石蜡包埋的肝组织常规制备切片，并行HE染色。免疫组化染色使用F4/80抗体(1∶100，MAB5580，RD)及LY-6G抗体(1∶100，MAB1037-100，RD)根据标准步骤进行染色。

六、 肝组织及RAW264.7细胞因子mRNA水平检测

LPS诱导鼠巨噬细胞RAW264.7常被用作细胞炎症模型，可评估化合物抑制炎症反应的效果。IL-6、IL-1β和TNF-α 作为经典的促炎性细胞因子，其表达水平可反映炎症的严重程度[8]。以20 μmol、10 μmol、5 μmol不同浓度的AT7519分别预处理RAW264.7细胞1 h，再给予LPS 1 μg/mL处理4 h后，RT-qPCR检测IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平。

取适量肝组织研磨后，使用RNA抽提试剂盒提取总RNA；细胞实验结束后吸弃培养基，用1×PBS清洗2遍。总RNA使用Naonodrop2000仪器测定，并用Hiscript q-RT SuperMix for qPCR试剂盒进行反转录。反转录所得cDNA用ChamQ SYBR Qpcr Master试剂盒进行RT-qPCR荧光定量检测肝组织表达的细胞因子水平。选取Gapdh为内参，数据使用2-△△CT法进行分析。所有引物均由上海擎科生物科技有限公司合成。引物序列如下： IL-6正向为CTGCAAGAGACTTCCATCCAG，反向为AGTG-GTATAGACAGGTCTGTTGG；IL-1β正向为GAA-ATGCCACCTTTTGACAGTG，反向为TGGAT-GCTCTCATCAGGACAG；Tnf-α正向为CAGGCG-GTGCCTATGTCTC，反向为CGATCACCCCGA-AGTTCAGTAG；Gapdh正向为AGGTCGGTG-TGAACGGATTTG，反向为TGTAGACCATG-TAGTTGAGGTCA。

七、统计学方法

结 果

一、AT7519对LPS诱导RAW264.7细胞炎症相关基因mRNA水平的影响

与对照组相比，模型组IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，不同浓度AT7519预处理组其表达水平均显著降低(P<0.05)，且其抑制炎性细胞因子的效果呈剂量依赖性，见表1。

二、AT7519对小鼠急性CCl4肝损伤肝组织病理学表现的影响

正常对照组小鼠肝细胞结构正常，肝小叶结构完整，未见病理改变；模型组小鼠肝细胞大片坏死，有较多点状或灶性坏死，并伴有大量炎性细胞浸润；药物干预组小鼠肝脏病理改变显著减轻，坏死灶较少，并且炎性细胞浸润明显改善，肝组织结构基本正常(图1)。进一步利用免疫组化方法检测各组小鼠炎性细胞浸润情况，F4/80检测肝组织巨噬细胞数量，LY-6G检测肝组织中性粒细胞数量。染色结果显示，与正常对照组相比，模型组F4/80和LY-6G棕黄色阳性细胞数量均明显增多；而药物干预组与模型组相比，其肝组织内F4/80和LY-6G阳性细胞数量显著减少(图2)。表明AT7519对CCl4诱导的ALI具有保护作用，并可减轻该模型中的炎症反应。

表1 AT7519对RAW264.7细胞促炎细胞因子表达的影响(±s)

图1 各组小鼠肝组织HE染色病理学表现(低倍放大) A 正常对照组；B 模型组；C 药物干预组

图2 各组小鼠肝组织F4/80及LY-6G免疫组化染色结果(低倍放大) A、D 正常对照组；B、E 模型组；C、F 药物干预组

三、3组小鼠ALT和AST水平的比较

与正常对照组相比，模型组小鼠血清ALT、AST水平显著升高(P<0.05)，提示造模成功CCl4可诱导小鼠肝功能受损；而AT7519干预组血清ALT、AST水平显著低于造模组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明AT7519对该模型中肝损伤具有保护作用，见表2。

表2 各组小鼠ALT和AST水平(±s)

四、AT7519对小鼠急性CCl4肝损伤肝组织细胞因子mRNA水平的影响

RT-qPCR结果显示，CCl4模型组小鼠肝组织内IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达水平较正常对照组显著升高(P<0.05)，经AT7519干预后上述促炎细胞因子mRNA水平显著降低(P<0.05)，见表3。上述结果表明AT7519可有效抑制急性CCl4肝损伤模型中肝组织炎性细胞因子表达，从而减轻炎症反应缓解肝损伤。

表3 各组小鼠肝组织细胞因子mRNA水平(±s)

讨 论

炎症反应可导致继发炎性介质分泌参与随后的细胞防御及组织修复，因而炎症反应终止在恢复组织稳态及功能的过程中起重要作用[9,10]。持续存在或反复发生的炎症反应可促进肝星状细胞激活最终导致纤维化，甚至肝癌[11-13]。因此，调控炎症反应在肝脏疾病进展中可能起到保护作用。

细胞实验证明，在LPS诱导的鼠巨噬RAW264.7细胞炎症模型中，AT7519可显著减少LPS诱导的炎性细胞因子表达水平，且其效果呈剂量依赖性。基于炎症反应在ALI进展中的关键作用及AT7519的抗炎作用，本研究进一步探究了AT7519对小鼠ALI的保护作用。CCl4诱导的ALI特点为肝小叶中央坏死，伴有血清转氨酶水平显著升高等[14]。本研究从组织病理及血清生化水平等方面，验证了AT7519可显著减轻CCl4所致ALI。此外，从炎症因子表达上也证实了AT7519可有效抑制CCl4刺激导致的炎症反应过度激活。

本研究从体内、体外实验分别证实了AT7519的抗炎作用，且可显著对抗小鼠CCl4诱导的ALI。其保护机制可能与减轻炎性细胞浸润、抑制炎性细胞因子分泌有关，从而减轻小鼠肝损伤中的炎症反应并起到保护作用。目前，临床尚缺乏针对ALI的有效治疗药物，AT7519的肝脏保护作用提示其可作为潜在的候选治疗药物。