AU结合因子1对肝细胞癌患者磷脂酰肌醇蛋白聚糖3水平的影响

张 婷，关贵文，张 婧，鲁凤民，陈香梅

北京大学基础医学院 病原生物学系，北京大学感染病研究中心，北京 100191

肝细胞癌(HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一, 位列癌症相关死亡率的第四位[1-2]。尽管最近在HCC临床治疗方面取得了很多进展，但其治疗效果仍然欠佳，HCC术后5年生存率只有15%[3]。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是一种硫酸肝素蛋白聚糖，位于细胞膜表面，在细胞增殖和分化中发挥重要作用[4-5]。研究[6-7]表明，GPC3在HCC中呈异常高表达，且具有很强的肿瘤特异性，被认为是HCC关键驱动分子。此外，GPC3表达水平与HCC的发生发展及预后密切相关，可作为HCC的诊断标志物和治疗靶点[4,8-9]。但GPC3在HCC中异常表达的机制尚未完全阐明。

腺苷酸-尿嘧啶富集元件(AU-rich elements，AREs)位于mRNA的3′UTR区，是最具特征的mRNA降解顺式作用因子。AREs可被ARE结合蛋白识别并结合，进而调控mRNA的稳定性及翻译[10-11]。AU结合因子1(AU-rich element RNA-binding factor 1，AUF1)也称异质核糖核蛋白D(hnRNPD)，是第一个被鉴定出的ARE结合蛋白[12-13]。大量研究[14-15]表明，AUF1高亲和力结合富含AREs元件的mRNA并调控其稳定性。本研究中，首次发现GPC3 mRNA的3′UTR区含有AREs序列，AUF1可结合GPC3 mRNA，增强其稳定性，从而上调HCC中GPC3的表达。

1 材料与方法

1.1 TCGA、LCI数据库 TCGA-HCC基因表达数据下载自美国Bead研究所基因数据分析中心(http：//gdac.broadinstitute.org)。采用FPKM (fragments per kilobase million) 法对TCGA转录组测序数据进行标准化，最终纳入371例不同病因的HCC组织及50例癌旁组织。

LCI-HCC基因表达数据下载自GSE14520(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), 最终纳入214例有随访信息的乙型肝炎相关HCC患者。

1.2 临床标本 35例HCC及配对癌旁样本选取自2009年—2013年在河南省肿瘤医院接受常规根治性手术的HCC患者。所有患者均经病理诊断确诊，且均未在手术前接受任何化学疗法或放射疗法。

1.3 肝癌细胞系 HepG2细胞购自美国ATCC细胞库，Huh-7细胞购自中国科学院上海细胞库。使用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、链霉素的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达约80%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取生长至对数期的细胞用于实验研究。

1.4 主要材料与试剂 siRNA购自广州锐博生物；pcdh-AUF1质粒为本实验室构建保存；细胞DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；转染试剂LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent、LipofectamineTM2000、Trizol、Protein A磁珠及蛋白定量试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂购自美国Roche公司；RNA合成抑制剂Actinomycin D和兔抗AUF1抗体购自Abcam公司；鼠抗人GPC3抗体和鼠抗人Tubulin抗体购自美国SantaCruz公司。

1.5 免疫组化实验 将石蜡块切成5 mm的切片，并用苏木精和曙红染色。使用AUF1和GPC3抗体染色并通过DAKO EnVision显色系统检测，采用Aperio Scan Scope GL虚拟扫描成像系统，并用Visio pharm软件进行分析。根据染色强度和对应的阳性细胞百分比对染色切片进行评分[15]：0分，阴性，0%；1分，弱阳性，<25%；2分，适中，25%～50%；3～4分，强阳性，> 50%。

1.6 细胞转染实验 转染前1天进行细胞传代并细胞计数，按照4×105个/孔将细胞接种于6孔板中。按照LipofectamineTMRNAiMAX的说明书，将siAUF1与对照siNC转染至HepG2与Huh-7细胞中。AUF1外源表达质粒和空载对照按照LipofectamineTM2000说明书进行转染。转染6 h后，更换新鲜培养基继续培养，并于转染48 h后收集细胞，用于后续实验研究。

1.7 Western-Blot实验 收集细胞沉淀，加入RIPA裂解液进行细胞裂解，BCA试剂测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭，一抗4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育1 h。用美国LI-COR公司 Odyssey双色红外激光成像系统采集图像，使用Tubulin作为内参。

1.8 细胞RNA提取和qRT-PCR 按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，用Nano-Drop2000测定RNA浓度。以1 μg总RNA为模板，用随机引物逆转录合成cDNA链。取1 μl逆转录产物，用SYBRGREEN法进行qRT-PCR。以管家基因C-TBP1作为内参，采用2-△△CT方法对目的基因的相对表达进行分析，实验所用引物序列如下。GPC3：F5′-GCGGTTACTGCAATGTGGTC-3′，R5′-TCTCAGTTTCAGTGGTGGTC-3′；AUF1：F5′-GATCAAGGGGTTTTGGCTTT-3′，R5′-GTTGTCCATGGGGACCTCTA-3′；C-TBP1：F5′-TTCACCGTCAAGCAGATGAGAC-3′，R5′-CTGGCTAAAGCTGAAGGGTTCC-3′。

1.9 RNA结合蛋白免疫沉淀实验 取1×107细胞加入350 μl RIP裂解液进行细胞裂解。将AUF1抗体或同型IgG对照与Protein A磁珠孵育2 h，洗去未结合的抗体后加入细胞裂解液上清，4 ℃孵育过夜。依次加入蛋白酶K和DNase I，消化蛋白和DNA。使用苯酚氯仿提取和乙醇沉淀分离出共沉淀的RNA，用qRT-PCR法定量检测GPC3表达。

1.10 RNA半衰期检测 将siAUF1与对照siNC转染HepG2与Huh-7细胞，48 h后，向细胞培养基中加入放线菌素D(5 mg/ml)抑制新的RNA合成。在加药处理后0、2、4、6 h，收集细胞并提取RNA，qRT-PCR法检测GPC3表达。

1.11 伦理学审查 本研究经北京大学医学部伦理委员会的批准，批号：IRB00001052-12088，并已获得所有患者的知情同意。

1.12 统计学方法 采用SPSS 24.0和GraphPad Prism5软件进行统计学分析。计量资料两组间比较采用t检验，计数资料两组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，并使用log-rank检验进行生存率的比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPC3和AUF1 mRNA在开放数据库HCC中的表达及相关性 GPC3 mRNA在HCC组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P值均<0.05)(图1)。在TCGA-HCC数据库中，GPC3 mRNA高表达的HCC患者5年总体生存率显著低于GPC3 mRNA低表达患者(P<0.05)；在LCI数据库中，GPC3 mRNA表达对与乙型肝炎相关HCC患者的预后无关(图2)。AUF1 mRNA在HCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P值均<0.05)(图3)。

图1 TCGA、LCA数据库中GPC3 mRNA的表达水平

图2 TCGA、LCI数据库中GPC3表达水平与HCC患者预后的关系

图3 TCGA、LCI数据库中AUF1 mRNA的表达水平

2.2 GPC3与AUF1蛋白在HCC组织中呈高表达 采用免疫组化方法检测了35例HCC样本中GPC3和AUF1蛋白的表达水平。结果显示，GPC3在HCC组织中高表达，大部分HCC细胞的胞膜和胞质中均可检测到GPC3，其中20例为强阳性染色(≥3分)、7例为中度阳性染色(2分)、8例染色较弱或呈阴性(<2分)。而在非肿瘤肝组织中几乎检测不到GPC3表达(图4)。AUF1也在HCC组织中呈高表达，显示出较强的胞核着色，其中16例为强阳性染色(≥3分)、10例为中度阳性染色(2分)、9例染色较弱或呈阴性(<2分)(图4)。

图4 GPC3与AUF1在HCC及癌旁组织中免疫组化染色结果

进一步分析显示，GPC3和AUF1蛋白均在HCC组织中呈高表达，阳性表达率分别为77.1%(27/35)和74.3%(26/35)。65.7%(23/35)的HCC组织中GPC3和AUF1均呈高表达。在27例GPC3阳性组中，23例(23/27,85.2%,)AUF1染色呈阳性，显著高于GPC3阴性组中AUF1阳性表达率(3/8，37.5%)(χ2=7.35，P<0.05)，提示HCC中AUF1可能调控GPC3的表达。

2.3 AUF1上调GPC3的表达 为了明确GPC3的表达是否受AUF1蛋白调控，在HCC细胞系中检测了AUF1敲减及过表达对GPC3表达的影响。结果表明，敲减AUF1显著下调了HepG2和Huh-7中的GPC3蛋白和mRNA水平(图5a)。相反，在Huh-7细胞中过表达AUF1则上调了GPC3蛋白和mRNA水平(图5b)。

注：a，敲减AUF1后，GPC3蛋白和mRNA水平；b,过表达AUF1后，GPC3蛋白和mRNA水平。

2.4 AUF1结合并稳定GPC3 mRNA 通过分析GPC3 mRNA的3′UTR区发现，该区域富含尿嘧啶，具有典型的AREs序列(图6a)。RNA结合蛋白免疫沉淀实验结果表明，HepG2和Huh-7细胞中的AUF1蛋白可结合GPC3 mRNA(图6b)。在HepG2和Huh-7细胞中敲减AUF1后，GPC3 mRNA的降解速度明显加快(图6c、d)，提示AUF1蛋白可以稳定GPC3 mRNA。

注：a,GPC3 3′UTR区潜在的AUF1结合位点示意图；b，RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测AUF1与GPC3 mRNA结合；c、d，RNA半衰期实验检测AUF1敲减对GPC3 mRNA降解速度的影响。

3 讨论

GPC3在HCC中呈异常高表达，已成为HCC的免疫治疗靶标[16]。既往研究表明，GPC3在HCC中异常表达可能与Myc的转录激活[17]和GPC3拷贝数增加[18]有关，但其具体机制尚未完全阐明。本研究探索了RNA结合蛋白AUF1对GPC3表达的调控作用，发现HCC细胞中AUF1蛋白可以结合并稳定GPC3 mRNA，进而上调GPC3表达。本研究首次揭示了HCC中GPC3异常表达的转录后调控机制，将为研发HCC新的治疗靶点提供依据。

GPC3是肝脏中的关键肿瘤驱动分子，与HCC的发生、发展和预后密切相关。与文献报道结果一致，本研究发现GPC3 mRNA水平在TCGA和LCI数据库所纳入的HCC组织中均显著高于癌旁组织，且在TCGA数据库中GPC3高表达的HCC患者5年总体生存率更低，提示GPC3高表达与HCC患者的不良预后有关。但在LCI数据库纳入的乙型肝炎相关HCC患者中，未见GPC3高表达与HCC患者不良预后有关。近年来基于高通量测序的研究[19]表明，与非乙型肝炎HCC不同，乙型肝炎相关HCC的分子分型以增殖型为主，且其组织学具有更高的侵袭性特征，包括细胞分化程度更低、更多的染色体不稳定及TP53突变等，提示乙型肝炎相关HCC发生发展中还有其特定的驱动因素。GPC3高表达在不同感染背景相关HCC中的预后作用不同，可能与乙型肝炎相关HCC更复杂的致病机制有关，但需要更深入的研究来确证。

AREs序列广泛存在于基因的3′UTR区，包括编码多种炎症因子、原癌基因、生长因子、细胞周期蛋白的基因。AREs序列可以被RNA结合蛋白识别，包括AUF1、HUR、TTP等[10-11]。AUF1是最早被发现的ARE结合蛋白，在包括HCC、乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤中表达上调[14-15]。通过数据库分析发现，HCC组织中的AUF1呈异常高表达，与文献报道一致。采用免疫组化方法进一步证实GPC3和AUF1蛋白在HCC组织中也呈高表达，且二者的表达水平呈正相关。以往研究[14-15]多认为AUF1与ARE结合后，发挥降解靶基因mRNA的作用，并进而抑制基因的表达。但近年有研究[14]发现，AUF1也可以稳定mRNA，并上调基因的表达，如食管癌中AUF1通过稳定mRNA上调GCH1蛋白表达。本研究发现，GPC3 mRNA的3′UTR区含有AREs序列，在HCC细胞中敲减AUF1能显著下调GPC3的表达水平，而过表达AUF1则上调GPC3表达。更为重要的是，HCC细胞中AUF1蛋白能与GPC3 mRNA结合，敲减AUF1后GPC3 mRNA的半衰期明显缩短。鉴于AUF1蛋白可以结合并稳定GPC3 mRNA，推测GPC3是AUF1调控的靶基因之一，HCC中AUF1的高表达是导致GPC3上调的一个重要机制。

由于AUF1是通过蛋白质结合GPC3 mRNA从而上调其表达水平，是转录后水平调控，因此在HCC数据库分析中并没有发现AUF1 mRNA与GPC3 mRNA水平间存在显著相关性。此外，已有文献[17]报道Myc可转录激活GPC3基因的表达，且HCC中还存在GPC3基因拷贝数增加，提示HCC组织中GPC3的表达上调包括基因组水平和转录水平的调控。

综上，本研究结果表明RNA结合蛋白AUF1是GPC3基因的新调控因子，可在转录后水平上调GPC3的表达，AUF1和GPC3蛋白的异常高表达可能参与了HCC的发生和发展。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：张婷负责课题的实施与论文撰写；关贵文、张婧负责数据库分析与图表整理；鲁凤民参与修改完善论文；陈香梅负责课题设计，指导撰写文章并最后定稿。