布舍瑞林在奶牛同期发情-定时输精中的应用效果分析

顾文源，苏硕青，刘 玉，冯春涛，蔺惠良，余文莉,3,4*，李树静,3,4*

（1.石家庄天泉良种奶牛有限公司，河北石家庄 050200；2.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄 050053；3.河北省奶牛良种繁育工程技术研究中心，河北石家庄 050200；4.河北省牛产业技术研究院，河北石家庄 050200）

定时输精（TimEd Artifical InsEmination，TAI）是根据家畜的繁殖和调控规律，利用外源激素对母畜批量处理，使母畜的发情、排卵具有可控性和一致性[1]，以确保每头符合条件的奶牛都能在理想的产后间隔内受精。Ovsynch 是第一个广泛使用的奶牛定时输精程序[2]，其主要使用促性腺激素释放激素（GnRH）和氯前列烯醇钠（PG）2 种激素，通过调控卵巢发育使处于不同发育阶段的卵泡达到同时排卵的效果，可直接进行人工授精[3]。采用同期排卵和定时输精程序可提高高产泌乳奶牛首次配种的参配率和每次人工授精的受胎率[4]。

在集中管理的高产奶牛群中，高产奶量与行为发情表现呈负相关，这表明无论是否检测发情，定时输精都可作为同步方案的一部分。输精前注射PGF2α和GnRH 或其类似物可对黄体和卵泡进行调控，从而实现同步排卵[5]。在美国至少有5 种GnRH 类似物的产品应用于奶牛同期发情-定时输精[2]。布舍瑞林（Buserelin）是GnRH的人工合成类似物，作为一种新的激素药品应用于同期发情处理，其作用于垂体，调控机理与GnRH 相同；布舍瑞林活性强，半衰期比GnRH 长。因布舍瑞林促黄体生成激素的能力强于促卵泡激素的释放，又被称为黄体生成素释放激素[6-7]。本研究通过分析布舍瑞林对试验奶牛生殖激素浓度、卵泡发育合格率及受胎率的影响，评估其在奶牛同期发情-定时输精中的应用效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验动物为177 头14～15 月龄、头胎产后（53±3）d 子宫复旧良好的荷斯坦泌乳牛。

1.1.2 试剂 冻精为进口荷斯坦奶牛冷冻精液。GnRH 的生产批号为B200601，规格为100 μg；布舍瑞林主要成分为促性腺激素释放激素改造的多肽，批号为190601，规格为40 μg；PG 生产批号为1911008，规格为0.322 mg。3 种试验药品均购自宁波三生生物科技有限公司。所用激素类药品均在有效期内，按使用说明贮存。

1.1.3 主要仪器、设备 输精枪（蒋氏动物用品有限公司）、台式离心机（型号为SC-04，购自安徽中科中佳科学仪器有限公司）、兽用B 超仪（型号HS-101V，Honda ElEctronics Co Ltd）、输精硬外套和软外套、一次性5 mL 注射器、采血针、含有促凝剂的真空采血管、15 mL 离心管。

1.2 实验方法

1.2.1 同期发情-定时输精、采血及血清生殖激素测定实验Ⅰ：随机选择21 头产后（53±3）d 的荷斯坦泌乳牛，分为阴性对照组、药物对照组和试验组。所有试验动物均采用Ovsynch（079）同期发情-定时输精方案，方案见表1。阴性对照组用10 mL 生理盐水处理，药物对照组用100 μg GnRH 处理，布舍瑞林组用20 μg 布舍瑞林处理，在第2 次注射布舍瑞林/GnRH/生理盐水后，在24 h 内，每隔2 h 按照无菌采集的标准在牛颈静脉部位用75%酒精棉球进行消毒，用无菌采血针采集5 mL 血液到含有促凝剂的真空管中，5 000 g×离心15 min，在超净工作台中吸取血清于无菌离心管，在-20℃条件下密封保存[2]，将血清送到北京莱博泰瑞科技发展有限公司，通过放射免疫分析法检测血清中促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P4）激素浓度。

1.2.2 同期发情-定时输精、卵泡分级、受胎检查方法实验Ⅱ：随机选择40 头产后（53±3）d 的荷斯坦泌乳牛，布舍瑞林组分别用10、20 μg 布舍瑞林处理，对照组用100 μg GnRH 处理。所有试验动物均采用Ovsynch（079）同期发情-定时输精方案，见表1。在第9 天注射药物后16～18 h 利用兽用B 超仪检测卵泡发育情况，直径1.0～2.5 cm 的卵泡为合格卵泡，大于2.5 cm 的卵泡定为卵泡囊肿，无卵泡和卵泡囊肿定为无排卵。对卵泡质量合格的牛进行输精（n=40 头），或模拟生产流程不经检测直接输精（n=116 头）。人工授精后第30 天利用B 超仪检测牛的受胎情况（P/AI）。

1.2.3 布舍瑞林对荷斯坦奶牛定时输精的效果分析 依据实验Ⅱ结果，选择116 头产后（53±3）d 子宫复旧良好的泌乳荷斯坦牛分成布舍瑞林组和GnRH 组，按表1方案进行处理，所有同期发情处理牛不进行发情观察和卵巢检查，直接进行定时输精。在人工授精后第30 天用兽用B 超仪检测受胎头数。

1.3 统计分析 均值数据采用SPSS 20 软件单因素方差分析，百分率采用χ2检验进行分析。P<0.01 表示差异极显著，P<0.05 表示差异显著，P>0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 布舍瑞林对荷斯坦奶牛体内生殖激素水平的影响分析 由图1 可见，在相同的采血时间点，3 组间FSH、LH、P4的浓度均无显著差异；而生理盐水组在24 h 的E2浓度显著高于GnRH 组和布舍瑞林组，其他2 组间差异不显著。

在不同的采血时间点，3 组FSH、LH、E2、P4激素存在一定差异。GnRH 组4 h 时的FSH 浓度显著高于22 h 和24 h，6 h 显著高于22 h；而生理盐水组内和布舍瑞林组内各采血时间点的浓度值均无显著差异。GnRH组和布舍瑞林组均在第2 次注射后4 h 时FSH 达到最高浓度，而生理盐水组的FSH 在16 h 达到最高浓度。

生理盐水组22 h 时的LH 浓度极显著高于0～18 h，24 h 显著高于0、2、8、12 h；GnRH 组22 h 的LH 浓度极显著高于2、4、12 h，显著高于0、6、8、10、14、16、18 h；布舍瑞林组20 h 极显著高于4、6、8、10 h，显著高于0、2、12、14、16、22、24 h，22 h 显著高于4、6、10 h，24 h 显著高于4、6、8、10 h。布舍瑞林组LH 浓度达到最高峰值比生理盐水组和GnRH组提前了2 h。

表1 同期发情-定时输精方案

各组内各采血时间点E2浓度之间差异均不显著。GnRH 组0、2、4、8 h 时的P4浓度极显著低于14 h，6 h 显著低于14 h，0、4 h 显著低于20 h，4 h 显著低于22 h；布舍瑞林组0、2、8 h 显著低于18 h；生理盐水组内各采血时点的浓度值均无显著差异。布舍瑞林组在第2 次注射后0 h，即PG 注射后48 h，E2达到最高浓度，P4达到最低浓度，而生理盐水组和GnRH 组分别延迟24 h/4 h 和10 h/4 h（E2/P4）。

图1 外源激素处理后母牛血清中FSH、LH、E2、P4的浓度变化

2.2 不同布舍瑞林剂量对荷斯坦泌乳牛同期发情处理的效果分析如表2 所示，10 μg 布舍瑞林组、20 μg 布舍瑞林组和GnRH 组的无排卵率无显著差异；20 μg 布舍瑞林组受胎率显著高于10 μg 布舍瑞林组，其他各组差异不显著。

表2 布舍瑞林不同剂量及GnRH 处理对奶牛同期发情定时输精效果的影响

2.3 布舍瑞林对荷斯坦奶牛定时输精的效果分析 如表3 所示，在检测卵泡和不检测直接输精的情况下，布舍瑞林20 μg 组受胎率略高于GnRH 组（P>0.05）。

表3 布舍瑞林对奶牛受胎率的影响

3 讨 论

母畜在正常的发情到排卵之间，FSH、LH、E2、P4浓度会发生一系列密切关联的消长变化。理论上，在基于GnRH 的同期发情定时输精方案中，第1 次注射GnRH（GnRH1）后将释放LH，使优势卵泡排卵，并使卵泡发育波同步，卵泡发育的同步波产生排卵卵泡。第2 次注射GnRH（GnRH2）是在注射PG 后进行的，目的是释放LH，并使GnRH1 处理产生的优势卵泡排卵[2]。张贺[8]研究发现，注射GnRH 外源激素不仅引起血浆中LH 水平明显升高，FSH 水平也明显升高。本研究中，GnRH 组和布舍瑞林组均在第2 次注射后4 h 时FSH 达到最高浓度，而生理盐水组的FSH 在16 h 达到最高浓度，3 组内的FSH 最低浓度与LH 最高浓度均同时出现，但布舍瑞林组均比其他2 组提前2 h（20 h vs 22 h）。

多项研究表明，在Ovsynch 程序中，GnRH1 排卵可改善情期受胎率，原因在其第1 次注射GnRH 后间接促进了母牛体内LH 和FSH 的释放，再通过注射PG 溶解发情周期的黄体，缩短黄体周期，牛群集中进入下一个发情周期，再进行第2 次注射GnRH 既能维持卵巢中卵泡的数量，又能促进黄体发育，进而改善了情期受胎率，但对在GnRH1 缺乏功能性黄体的奶牛来说这种影响受到限制[9-10]。第1 次注射GnRH 的排卵反应取决于使用GnRH 时的发情周期阶段，在发情周期的第5～9 天奶牛排卵率最高，并确保在排卵卵泡发育期间P4浓度升高[10]。血浆P4水平为0.5 ng/mL 的奶牛被认为是“同步的”[11]。注射PG 会使功能黄体消溶[12]，黄体退化使LH 脉冲频率增加，优势卵泡增加其生长迅速并产生较高浓度的E2，E2对下丘脑-垂体轴起正反馈作用，导致LH 激增，出现LH 峰，随后促进排卵，形成黄体[13]。Masoumi 等[14]研究发现，注射PG 后48 h 血中P4浓度未降至0.5 ng/mL时，怀孕的可能性将显著降低。Nowicki 等[15]研究发现，在GnRH2 处理后P4浓度高（P4>1ng/mL）比P4浓度低（P4<0.5ng/mL）的奶牛妊娠率低，妊娠损失高。正常生理状态下，母牛外周血浆中P4含量在发情时最低（<1 ng/mL），E2含量最高（15～25 Pg/mL）[16-18]。定时输精在GnRH2 处理后16～18 h 进行，排卵发生在GnRH2 处理后24 h 内[11]。本实验中，布舍瑞林组在第2 次注射后0 h，即PG 注射后48 h，E2达到最高浓度，P4达到最低，而生理盐水组和GnRH 组分别延迟24 h/4 h 和10 h/4 h（E2/P4）；3 组血中P4浓度均低于0.5 ng/mL，生理盐水组在24 h 时的E2浓度显著高于GnRH 组和布舍瑞林组，其他2 组差异不显著。本研究表明，布舍瑞林第二次注射后0 h，P4和E2浓度的关联性变化，与正常生理状态下母牛发情时两激素浓度的关联性变化比GnRH 更一致，生理盐水组母牛的排卵时间可能迟于其他2 组。本研究布舍瑞林组LH 峰值比GnRH 组提前2 h 出现，是否2 组奶牛的发情时间有所不同，有待进一步研究。

Bamber 等[19]研究显示，初产和经产牛产后50～65 d 无排卵发生率分别为29.6%和19.1%。本研究中，在产后（53±3）d，10 μg 和20 μg 布舍瑞林组及GnRH 组的奶牛无排卵发生率分别是14.3%、27.3%和6.7%。Pursley 等[20]用Ovsynch 程序在奶牛场获得的受胎率（P/AI）与观察发情后人工授精的受胎率相似（39% vs 37%）；Poock 等[2]的研究中采用Ovsynch 方案，母牛产后首次授精受胎率为38.8%，夏季授精的母牛受胎率低于冬季授精的母牛。Ricci 等[4]研究表明，实施Ovsynch 方案后的荷斯坦母牛受胎率在19.8%～33.0%。在基于Ovsynch 的程序中，GnRH 产品对首配奶牛的受胎率没有影响[2]。本研究中，在检测卵泡和不检测直接输精的情况下，20 μg 布舍瑞林组的受胎率略高于GnRH 组。

4 结 论

本实验条件下，20 μg 布舍瑞林可安全、有效地用于奶牛同期发情-定时输精程序。