基于网络药理学探讨菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症的作用机制

赵 琦，王继升，代恒恒，陈子龙，冯隽龙，闫 菲，李海松

（北京中医药大学，北京100029）

男性不育症指的是夫妻之间有规律的性生活1 年以上，在未采取任何避孕措施之上，由男方原因使女方无法受孕的一种疾病。据统计，世界范围内不孕不育的发病率已超过15%，其中男性因素所占比例超过50%［1］。随着环境、食品、心理等因素及生活方式的变化，男性精子密度呈现以每年1.40%～2.15% 的比例快速下降［2］。目前，男性不育症的病因研究仍不清楚，现有的治疗措施包括如雌激素受体调节剂、精子营养剂、抗生素等对症治疗为主，临床疗 效 值 得 商 榷［3，4］。随 着 二 胎 政 策 的 放 开，男性不育症的治疗面临越来越巨大的挑战，因此寻找更好治疗手段也成为当前领域的热门话题。

男性不育症在中医中多归属为“不育”“少子”等范畴。中医认为男性不育症的核心病机为肾精亏虚，临床上常采用补肾填精之法［5］。菟丝子-枸杞子药对可见于多首补肾育精名方如五子衍宗丸、左归丸、右归丸、观音救苦丸、长春广嗣丹、延龄育子丸、经验广嗣丸等，是治疗男性不育症常用药对［6］。药对中菟丝子温补肝肾为阳，枸杞子滋补肝肾为阴，二者配伍阴阳同调，用药阴中求阳，阳中求阴，从而达到阴阳平衡，阴阳同补的用药范式，体现了治疗男性不育症“以肾虚为本，以补肾生精为则，以微调阴阳为法”的治疗理论［7］。网络药理学是近年来兴起的研究中药药理机制的新型学科，其通过对当前中药药理学、高通量生物信息学、高端数据分析软件系统整合，对中药作用机制可进行全面分析［8］。因此本文将采用网络药理学方法对菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症的主要成分、关键靶点和信号通路进行挖掘，并预测其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 菟丝子-枸杞子药对活性成分与潜在靶点筛选

本研究将在中药系统药理学分析平台（TCMSP）和中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN）中检索菟丝子-枸杞子药对的全部化学成分。TCMSP 包含了499 味中药及其所对应的化合物成分（约29 000 种），并提供了每种化合物相对全面的药物活性数据，是最重要的中草药化合物成分数据库。BATMAN能够系统展示每种中药所含化学成分，能预测其中重要靶点，并进行生物信息学分析，能够帮助研究者全面的理解中药药理作用。并根据化合物口服生物利用度（OB）≥30% 和类药性（DL）≥0.18 作为活性化合物的筛选条件，将两个数据库的成分预测靶点合并，建立菟丝子-枸杞子化学成分-靶点数据集。

1.2 疾病靶点筛选

以“Male Infertility”为关键词，检索并筛选在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim. org）疾 病 靶 标 和 GeneCards 数 据 库（https：//genealacart.genecards.org/）中相关度≥5相关靶标，删除重复后得到男性不育症相关靶点信息。

1.3 药对-活性成分-作用靶点网络构建

通过构建中药-疾病靶标韦恩图，得到中药靶点和疾病靶标的共同靶点，最后得到药物成分靶点-男性不育症疾病靶点映射信息。利用Cytoscape3.6.1 软件构建“药对-活性成分-作用靶点”调控网络。其中“节点”信息包括中药，药物活性成分和作用靶点，节点与节点之间关系用“边”表示。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将男性不育症与菟丝子-枸杞子药对的共同 靶 点 导 入STRING 数 据 库（https：//string-db.org/，ver.11.0）中进行PPI 分析。筛选条件选择为“Homo sapiens”，并且选择最小互作分数值为0.700，最终构建PPI 网络图。将PPI 的结果导入Cytoscape 软件进行可视化展示。根据软件中Cytohubba 插件MCC 算法分析出核心程度最高的前八位蛋白，最终可预测出潜在核心靶标。

1.5 基因本体（GO）功能京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

利 用 David 数 据 库（https：//david. ncifcrf.gov/）对共同靶点蛋白进行GO 功能和KEGG通路富集分析。GO 功能分析主要用于描述基因靶点的功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能。KEGG 富集分析可以得到药对和男性不育症共同靶点所富集的信号通路。GO 和KEGG 分析均以P<0.05 表示具有统计学意义。

1.6 成分-靶标-通路网络构建

筛选KEGG 排名前20 通路，并结合文件检索，得到可能与男性不育症治疗相关通路，并找到富集在通路上对应的靶标，并于菟丝子-枸杞子药对中活性成分对应，最终构建“成分-靶标-通路”多元网络关系图。

2 结果

2.1 菟丝子-枸杞子活性成分与潜在靶点筛选

在TCMSP 和BATMAN 中检索菟丝子-枸杞子的化合物成分，并根据OB≥30% 和DL≥0.18 对化合物进行筛选后，最终得到52 种潜在核心化合物，预测出化合物对应靶点242 个。

2.2 男性不育症靶标筛选

在OMIM、Gene Cards 数据库检索男性不育症相关靶点，并结合相关文献删除重复后共得到靶标7 661 个。通过构建韦恩图，从中获得菟丝子- 枸杞子药对和疾病共同靶点113 个。见图1。

2.3 药对-成分-靶点-疾病调控网络构建

将菟丝子-枸杞子药对活性成分与男性不育症共同靶点信息及映射关系导入到Cytoscape软件，建立“药对-成分-靶点-疾病”网络图，见图2。 通 过Cytoscape 的Network Analyzer 功 能可对构建的网络进行拓扑结构分析，用Degree表示节点重要性。在本网络中，Degree 前五位化合物为Quercetin（槲皮素），Kaempferol（山萘酚），Isorhamnetin（异 鼠 李 素），Glycitein（甘 氨酸），Stigmasterol（豆甾醇）。

2.4 PPI 网络的构建

图1 菟丝子-枸杞子药对-男性不育症靶标韦恩图Fig 1 Targets Venn diagram of Cuscuta-Medlar CM and male infertility

将113 个共同靶点导入STRING 中，选择高置信度0.700，下载PPItsv 文件导入到Cyto‐scape，得到PPI 网络图，图中共有114 节点和794 条边。根据Cytohubba 插件中MCC 算法，可得到了潜在候选前 8 位基因，包括 IL6、MAPK1、MMP9、TNF、EGF、ICAM1、PTGS2、AKT1。见图3、4。

2.5 GO 功能富集分析

图2 药对-成分-疾病-靶点调控网络Fig 2 The regulatory network of CM-ingredient disease-target

图3 菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症潜在靶标相互作用网络Fig 3 The interaction network of candidate targets of CM against male infertility

图4 菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症潜在靶标互作前8 位网络图Fig 4 The interaction network of Top8 CM candidate tar⁃gets against male infertility

为了更好地理解菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症潜在药理活性，DAVID 数据库可对共同靶点进行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析结果提示菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症基因生物过程（BP）显著富集在氧化应激、细胞增殖、激素调节、凋亡等过程；细胞组分（CC）主要富集细胞外空间、细胞外区域、细胞器、细胞链接等部位；在分子功能（MF）主要富集在蛋白连接、分子功能调节、催化活性、抗氧化活性等。见图5～7。

图5 菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症的潜在靶标的BP 分析Fig 5 GO pathway enrichment analysis for biological processes of candidate targets from CM against male infertility

2.6 KEGG 功能富集

KEGG 富集分析得到信号通路113 条，结合文献检索并删除与“cancer”相关通路，根据P 值大小，选择显著性较高的前20 条通路进行气泡图绘制。与不育症相关的重要的信号通路包括：TNF 信号通路、细胞凋亡、PI3K-Akt 信号通路、FoxO 信号通路、甲状腺激素信号通路、Toll 样受体信号通路等。见图8。

图6 菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症的潜在靶标的CC 分析Fig 6 GO pathway enrichment analysis for cellular component of candidate targets from CM against male infertility

图7 菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症的潜在靶标的MF 分析Fig 7 GO pathway enrichment analysis for molecular function of candidate targets from CM against male infertility

2.7 成分-靶标-通路网络

根据KEGG 通路富集的结果，结合文献得到可能具有男性不育症治疗作用的通路，并将通路中富集的蛋白与枸杞子-菟丝子药对的活性成分与潜在靶点相映射，得到药对活性成分-靶表-通路网络图，并用cytoscape 软件可视化展示。如图9 所示，菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症涉及槲皮素、山奈酚、谷甾醇、β-谷固醇等24 种成分，其对应的靶标主要包括AKT1、MAPK1、IL6、TNF 等43 个，以上靶标可富集在TNF、PI3K-Akt、FoxO 等通路中。见图9。

图8 KEGG 通路富集前20 位气泡图Fig 8 Top 20 bubble map of KEGG pathway enrichment

图9 “成分-靶标-通路”网络关系图Fig 9 “Component-target-pathway”network

3 讨论

全世界大约有15%夫妻无法生育，其中男性因素约占不育病例一半以上。由于一线推荐药物不确定的疗效和副作用，临床仍需要更加有效的治疗选择。中医治疗男性不育症有一定优势，中药药对是中医临床遣药组方常用的配伍形式，是在中医理论指导下，长期临床实践经验中总结而成，体现了方剂隐含规律和辨证施治内涵。中医中菟丝子-枸杞子是治疗男性不育症的常用药对，中医处方中多作为核心药物出现。菟丝子味辛、甘，性平，有补益肝肾，固精缩尿功效；枸杞子甘、平，有滋补肝肾，益精明目之功。药理学研究表明，二者均有抗炎、抗凋亡和提高免疫力作用。然而，菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症的潜在机制仍不清楚，因此，本文设计了网络药理学方法进一步探索药对的药理机制。

通过药理活性筛选，得到菟丝子枸杞子药对有效成分52 个，包括槲皮素、山萘酚、甘氨酸、豆甾醇等。其中槲皮素是黄酮类化合物，具有很好的抗炎、抗氧化应激等保护作用［9］。研究表明，槲皮素能够显著改善白细胞精子症患者精子运动活力。经槲皮素治疗后，患者精子中精子中mtDNA 的含量显着下降，而精子中Cyt B 和NADH 5 的含量显着增加，从而改善精子过度活化运动和顶体反应的作用［10］。山奈酚能明显改善糖尿病大鼠精子的SOD，CAT，GPx 等氧化应激产物，降低精子的NF-κB 和TNF-α 等炎症因子水平，从而改善精子损伤［11］。豆甾醇、β-豆甾醇等属于植物甾醇类。植物甾醇是重要的营养剂能够促进动物发育，同时还具有降低胆固醇减少心血管病的风险［12］。研究表明，在食物中添加植物甾醇可显著增加精子数目和精子活力，同时降低精子中氧化应激反应［13］。因此可推测以上化合物是治疗男性不育症的核心化合物。

网络药理学结果显示菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症潜在靶点包括IL-6、MAPK1、MMP-9、TNF、EGF、ICAM-1 等。IL-6 是由巨噬细胞分泌的炎性细胞因子，参与体内的炎症反应，不育患者精液 中 炎 症 因 子 如IL-6 水 平 明 显 升 高［14］。TNF-α 是一种免疫调节剂，主要能够促进炎症反应，有报道白细胞精子症的不育患者精液中TNF-α 较正常患者升高，同时患者精子数目减少［15］。EGF 与雄性动物的生殖密切相关。适当剂量的EGF 能特异性地通过EGFR 介导促进精原干细胞的增殖，并且这种增 殖 效 应 呈 时 间 依 赖 性［16，17］。MAPK 是MAPK 信号通路重要组成部分，MAPK 与男性精子的增殖、炎症、分化、凋亡等过程密切相关［18］。细胞黏附分子-1（ICAM-1）是细胞黏附分子的免疫球蛋白超家族的成员，是血液-睾丸屏障的组成部分。研究表明，ICAM-1 在睾丸支持细胞和生殖细胞，尤其是精原细胞，正常睾丸的伸长和伸长精子中检测到ICAM-1 免疫反应，参与维持睾丸内环境稳态［19］。MMP-9 是基质金属蛋白酶（MMP）家族的重要组成成分，提高MMP-9 含量能够有效减轻精索静脉曲张诱导的生精障碍［20］。

KEGG 富集分析显示，菟丝子-枸杞子药对治疗男性不育症靶点通路主要集中在TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、FoxO 信号通路、细胞凋亡、Toll 样受体信号通路等。TNF 信号通路是炎症反应的核心信号通路，在男性生殖发育密切相关［21］。多种外界不良因素，如化学物质刺激，应激状态，辐射等均可见TNF 信号通路的参与，诱导精子损伤和数 目 下 降［22，23］。PI3K-Akt 信 号 通 路 是 人 体 重 要 信号通路，参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节［24］。研究表明，黄曲霉毒素可通过PI3K-AKT-mTOR 通路诱导精子细胞自噬，从而对男性生育功能造成损伤［25］。FoxO 信号通路是是FOX 蛋白转录因子的超家族，参与寿命、抗应激、凋亡、细胞增殖、分化和代谢等多种生命体过程，在男性生殖功能中也发挥了强大的调节作用［26］。FOXO能够调控精原干细胞（SSC），促进精子的生发，并且Foxo3 和Foxo4 的综合缺乏导致SSC 自我更新严重受损和完全分化障碍，这表明Foxo3 和Foxo4 尽管对雄性育种是必不可少的［27］。细胞凋亡通路是精子生成相关的重要通路，其中Caspase-3，Caspase-8，Bax，Bcl-2，都是凋亡通路的重要分子，多种信号通路分子如FoxO 通路，PI3K 通路均可影响凋亡通路相关蛋白，抑制精子细胞凋亡，促进生精过程［28］。Toll 样受体主要在体内发挥免疫识别和免疫调控作用，TLR 识别LPS、GpG-DNA、肽聚糖、脂蛋白等外源性物质并介导清除，是重要的免疫性信号通路。动物实验显示TLR 能够明显抑制LPS 造成大鼠精子细胞凋亡［29］。于此同时，VEGF signaling pathway和MAPK signaling pathway 均在精子生成，抑制精子损伤中发挥重要作用［30］。

综上所述，本研究借助网络药理学方法从多层面，多角度揭示了菟丝子枸杞子药对对于男性不育症的作用，深入揭示了药对参与调控男性不育症靶基因的性能。本研究的局限在于，通过网络药理学发现药理活性成分和靶点是理论预测的结果，应通过实验进行验证，后续研究将集中于使用动物实验和临床研究来验证该假设，以提高临床用药的合理性和科学性。