伊布替尼联合CD19嵌合抗原受体T细胞治疗难治复发弥漫大B细胞淋巴瘤的临床研究

董 林， 王耀辉， 叶世光， 周莉莉， 李 萍， 梁爱斌

(1. 同济大学医学院，上海 200092; 2. 同济大学附属同济医院血液科，上海 200065)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lym-phoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)中最常见的组织学亚型，在亚洲国家的发病率超过40%[1]。研究表明，58%～75%的DLBCL患者接受利妥昔单抗联合环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松(R-CHOP)一线方案化疗可获得完全缓解(complete response， CR)，但仍有50%的患者缓解后复发或对化疗不敏感。复发的患者虽可接受挽救性的大剂量化疗联合自体造血干细胞移植，但患者总体反应率和CR率不高[2-3]。对于大多数复发性或难治性DLBCL患者，常规化学免疫治疗方案仅能短暂控制疾病。原发性难治性疾病患者采用二线化疗方案治疗时极少能获得CR。随着嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T, CAR-T)治疗的兴起与成熟，CAR-T细胞治疗难治复发 DLBCL患者被广泛应用。

CAR-T细胞治疗是一种基因改造的自体免疫治疗方法。美国FDA已批准针对CD19的CAR-T 细胞(chimeric antigen receptor T cells recognizing CD19， CD19 CAR-T) 免疫治疗用于二线或二线以上全身治疗后复发或难治的DLBCL患者。临床研究显示，目前CD19 CAR-T细胞治疗对于难治复发DLBCL的缓解为40%～50%[4-5]，与此相对，CD19 CAR-T在治疗难治复发急性B淋巴细胞白血病中的缓解率高达83%[6]。这表明CD19 CAR-T细胞治疗对难治复发DLBCL的疗效尚有提高空间，如何提高CART治疗DLBCL的疗效成为当前的研究热点。

DLBCL可根据基因表达谱(gene expression profile, GEP)分为生发中心 B细胞样(GCB)和活化 B 细胞样(ABC)亚型。研究显示，两种亚型的5年无进展生存率(progression-free survival， PFS)和总体生存率(overall survival， OS)分别是 76%vs31%、80%vs45%[7]，因此，ABC亚型的DLBCL预后更差，现已成为难治复发DLBCL的主要类型。

CD79突变[8]、CBM复合体异常[9]、髓样分化初级应答基因88(MYD88)突变[10]、重组人肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)功能缺失[11]导致的NF-κB通路的持续激活是ABC亚型的 DLBCL最具特色的分子病理学改变。针对该通路的异常激活，目前已有多种药物被应用于临床，如来那度胺、硼替佐米和伊布替尼。其中，伊布替尼是 Bruton 络氨酸激酶的抑制剂，在具有MYD88和CD79A 或CD79B 突变的DLBCL 细胞中，可降低多种蛋白质的酪氨酸磷酸化，同时也降低了Src家族激酶中脾酪氨酸激酶(Syk)和Btk的磷酸化，从而抑制肿瘤生长[10]。Winter等[12]发现，伊布替尼对DLBCL的客观缓解率为28%，其中GCB型患者的客观缓解率为18%，非GCB型患者的客观缓解率为21%。另一项关于伊布替尼治疗难治复发DLBCL的研究显示： 伊布替尼对BCR或MYD88基因突变的ABC亚型患者更为有效[13]。因此，伊布替尼对于复发难治DLBCL具有一定的疗效。目前国际上已有伊布替尼联合CD19 CAR-T治疗难治复发慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的临床试验。Gauthier等[14]发现，伊布替尼联合CD19 CAR-T对难治性CLL的客观缓解率为83%，且无严重的细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome， CRS)。对伊布替尼无效或不耐受的复发难治CLL患者可从该联合疗法中获益。目前，伊布替尼联合CD19 CAR-T治疗难治复发DLBCL尚缺乏相关研究。

本研究回顾性分析评估伊布替尼联合CD19 CAR-T方案治疗难治复发DLBCL患者的疗效和安全性，以期为难治复发DLBCL的治疗提供临床思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月—2019年1月在同济大学附属同济医院血液科采用CD19 CAR-T治疗的26例难治复发DLBCL患者作为研究对象。根据既往是否接受口服伊布替尼治疗，采用随机数字表方法将患者分为两组： 对照组(n=10)和伊布替尼组(n=16)。所有患者均符合本科CD19 CAR-T治疗难治复发B细胞淋巴瘤的临床试验标准(注册号： NCT02537977)。该试验的入组标准为： (1) 明确诊断复发难治DLBCL且肿瘤表面存在CD19 表达的患者，诊断标准依据NCCN非霍奇金淋巴瘤2017.V5标准；(2) 理解并愿意参加本项临床试验并签署知情同意书；(3) 年龄18～75岁；(4) 通过静脉能够获得足够的外周血，对淋巴细胞采集没有其他禁忌证；(5) 预计生存期>3个月；(6) 有可测量和可评估的淋巴瘤病灶作为疗效评估；(7) 前期未接受过任何其他细胞修饰治疗。排除标准为： (1) 合并其他种类的恶性肿瘤史；(2) 不 受控制的阳性感染。乙型或丙型肝炎阳性且处于活动期，患有精神疾病，包括痴呆、癫痫、重度抑郁等；(3) 严重或不受控制的全身性疾病或任何不稳定的系统性疾病；(4) 怀孕或哺乳期女性。

1.2 治疗方案

对照组所有患者研究用药开始前3个月内未接受过任何临床试验药物；伊布替尼组患者既往接受过口服伊布替尼规范治疗，1次/d，每次560 mg，至少3周，研究用药开始前3个月内未接受过伊布替尼外任何临床试验药物。对照组(n=10)和伊布替尼组(n=16)患者在CD19 CAR-T细胞输注前均采用FC方案(氟达拉滨25 mg/m2、环磷酰胺300 mg/m2)预处理，CD19 CAR-T剂量为3×106/kg。

1.3 观察指标

统计患者姓名、性别、年龄、淋巴瘤亚型、CAR-T前化疗次数、血常规、血生化、细胞因子、体温、血压、疗效评估、不良反应等指标，并随访患者生存。淋巴瘤分期采用Ann Arbor系统。根据IPI评分标准进行淋巴瘤预后评分。根据2017年NCCN指南非霍奇金淋巴瘤疗效评估标准进行疗效评估。根据NCI-CTCAE4.0版抗肿瘤药物毒性分级标准进行不良反应定义和分级。

1.4 统计学处理

采用SPSS22.0进行数据分析，采用t检验、Fisher确切概率法比较两组患者临床特征差异。非正态分布的数据，连续性变量以四分位数进行表示，选择 Wilcoxon 秩和检验进行分析。采用Kaplan-Meier分析法进行生存分析，并采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学差异。

2 结 果

2.1 患者疗效评估

本研究的研究对象共26例，其中男性17例，女性9例；患者中位年龄59岁(18～71岁)，GCB 型7例，non-GCB型19例。26例患者接受CD19 CAR-T治疗前中位化疗次数9次(4～15次)，14例患者处于化疗或自体造血干细胞移植后复发状态，12例原发难治患者处于疾病稳定或进展状态。26例患者接受CD19 CAR-T治疗后，10例(38.5%)CR，8例(30.8%)PR，4例(15.3%)稳定，4例(15.3%)进展，总反应率为69.2%。两组患者的临床资料见表1。

表1 26例患者基本临床资料及疗效Tab.1 Clinical characteristics and treatment efficacy of 26 patients

续表

两组患者的性别、年龄和DLBCL亚型分布均衡，Ann Arbor分期、IPI评分、既往是否骨髓移植比率、CART前化疗次数差异无统计学意义(P>0.05)。对照组10例患者中，3例(30%)获得了CR，1例(10%)PR，3例(30%)稳定，3例(30%)进展，总有效率(CR+PR)为40%(4/10)。伊布替尼组16例患者中，7例(43.7%)CR，7例(43.7%)PR，1例(6%)稳定，1例(6%)进展，总有效率为87.5%(14/16)。伊布替尼组患者总有效率(87.5%)远高于对照组(40%)，差异有统计学意义(P<0.05)；伊布替尼组患者CR率高于对照组(43.7%vs30.0%)，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。两组PFS(图1)和OS(图2)差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 两组患者CD19 CAR-T治疗后PFS曲线分析Fig.1 PFS curve of two groups after CD19 CAR-T therapy

图2 两组患者CD19 CAR-T治疗后OS曲线分析Fig.2 OS curve of two groups after CD19 CAR-T therapy

表2 两组患者治疗情况Tab.2 Basic information of treatment in two groups

2.2 不良反应评估

26例可评价的患者中，19例(73%)出现CRS，包括6例2级CRS(对照组2例、伊布替尼组4例)，13例1级CRS(对照组5例、伊布替尼组8例)，多发生于CAR-T治疗后的4～14 d。对照组和伊布替尼组患者CRS发生率差异无统计学意义(70.0%vs81.0%，P>0.05)；伊布替尼组有2例患者出现神经系统症状，1例表现为头晕、写字手抖，另1例患者表现为嗜睡、计算力减退，对照组患者未出现神经系统不良反应；对照组和伊布替尼组患者神经系统症状发生率差异无统计学意义(12.5%vs0.0%，P>0.05)；3例患者出现粒细胞减少，其中对照组2例，伊布替尼组1例，两组差异无统计学意义(20.0%vs6.2%，P>0.05)；伊布替尼组患者出现1例血小板减少，1例皮疹和1例乙肝再激活引起的爆发性肝炎，对照组患者未出现血小板减少、皮疹、肝炎病毒再激活，对照组和伊布替尼组这3种不良反应发生率差异无统计学意义(0.0%vs6.2%，P>0.05)；伊布替尼组1例患者出现肺部感染，对照组1例患者出现尿路感染，两组差异无统计学意义(10.0%vs6.2%，P>0.05)，见表3。

表3 两组患者不良事件严重度评估Tab.3 Severity assessment of adverse reaction in two groups

2.3 细胞因子表达水平分析

统计所有患者在输注CD19 CAR-T细胞前及输注后血清细胞因子水平，分析患者细胞治疗后体内细胞因子水平变化。标本采集时间点为输注CD19 CAR-T细胞当天清晨、输注后第1、4、7、10、14、21、28天早晨。分析比较输注后第28天内细胞因子最高水平与输注前的差异。结果发现，与输注CD19 CAR-T细胞前相比，输注后患者血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著性升高，(P均为0.000、0.000、0.000)，同时分析了患者CRP的水平，发现输注后CRP也有明显的升高趋势(P=0.000)，见表4。比较对照组和伊布替尼组两组患者输注CD19 CAR-T细胞后血清中IL-6、IL-8、TNF-α、CRP的表达，发现伊布替尼组患者各细胞因子表达水平高于对照组患者，差异无统计学意义(P>0.05)，见表 5。

表4 26例患者CD19 CAR-T细胞治疗前后细胞因子水平及CRP差异比较Tab.4 Comparison of cytokine and CRP level in 26 patients before and after CD19 CAR-T cell therapy [M(P25，P75)]

表5 两组患者CD19 CAR-T细胞治疗后细胞因子水平及CRP差异Tab.5 Comparison of cytokine and CRP level between two groups after CD19 CAR-T cell therapy [M(P25，P75)]

3 讨 论

近年来，国内外多项临床试验证实CAR-T细胞疗法在治疗难治复发的淋巴细胞白血病和淋巴瘤中具有显著疗效[15-16]。在本研究中，CD19 CAR-T治疗的对照组(n=10)患者总有效率为40%，中位无进展生存期7个月，伊布替尼组(n=16)患者总有效率为87.5%，远高于对照组。这提示伊布替尼联合CD19 CAR-T治疗与单用CAR-T相比较，能显著提高难治复发DLBCL患者的总反应率。伊布替尼联合CD19 CAR-T治疗组DLBCL患者总体反应率显著高于单独CAR-T治疗组的主要原因在于： 一方面，伊布替尼可改善患者本身T细胞的耗竭状态，增强自身T细胞在体外扩增的能力[17]；另一方面，伊布替尼可以联合CAR-T治疗可以减少T细胞上免疫抑制信号程序性细胞死亡蛋白-1(progra-mmeddeath-1， PD-1)的表达，同时也减少了B细胞上免疫抑制信号B100的表达。此外，伊布替尼也可促进CAR-T细胞的迁移及疗效[18]。本研究中，伊布替尼组患者总体生存与对照组相比无显著差异，PFS和OS有待提高，可能与病例数有限，随访时间短有关。CAR-T疗法在取得疗效的同时，也存在很多不良反应，如CRS、神经系统毒性、感染等，其中以CRS最为常见[15]。研究[19]发现，CRS发生率为76.2%，起始于CAR-T细胞输注后的6～20 d，其中1～4级CRS分别占比为38.1%、9.5%、14.3%、14.3%。本研究对照组10例患者中，7(70%)例患者出现CRS，其中1～4级CRS分别占比为50.0%、20.0%、0%、0%，多发生于 CAR-T治疗后的4～14 d。CRS发生率及出现时间与既往研究相似，但对照组10例患者未出现3级及3级以上的CRS，推测可能与研究中使用FC方案预处理降低了淋巴瘤患者肿瘤负荷及严密监测患者反应情况并及时对症处理有关。本研究比较了CD19 CAR-T治疗对照组和伊布替尼组患者的不良反应发生率，结果显示无统计学意义，这提示伊布替尼联合CD19 CAR-T治疗与单用CD19 CAR-T比较，不增加CAR-T的毒副反应。

TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10等细胞因子水平变化与CRS诊断密切相关。本研究比较26例患者治疗前后细胞因子表达水平变化发现，与输注CD19 CAR-T细胞前相比，26例患者输注后血清中IL-6、IL-8、TNF-α 水平显著升高。伊布替尼组患者输注CD19 CAR-T细胞后血清中IL-6、IL-8、TNF-α和CRP的表达显著高于对照组患者，这提示伊布替尼不会增加CAR-T治疗时CRS相关炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α及CRP的表达。

综上所述，口服伊布替尼的患者进行CD19 CAR-T细胞治疗后疗效显著，且CRS发生率与对照组相比无显著性差异，这表明伊布替尼联合CD19 CAR-T细胞治疗难治复发 DLBCL具有良好的疗效与安全性。由于本研究样本量较少，且伊布替尼治疗与CD19 CAR-T治疗存在一定时间间隔，未来仍需扩大伊布替尼与CD19 CAR-T同步治疗的临床样本进行进一步验证。