基于Nrf2/ARE通路研究银杏叶滴剂对口腔溃疡大鼠的作用机制*

郑蕾，李国芳，杨盼盼，单志鸣

郑州大学附属儿童医院，河南 郑州 450000

近年来，随着生活节奏的加快及饮食结构的改变，口腔溃疡的发生率明显升高。据临床调查[1]，复发性口腔溃疡发生率已达20%，对患者的生活和工作有诸多不便。口腔溃疡属于口腔黏膜的常见病，其病灶部位常伴随充血水肿、灼痛感，严重者可影响饮食和语言交流，且根治困难[2-3]。目前，临床治疗口腔溃疡多以对症治疗为主，包括补充维生素、抗感染等，但部分患者治疗效果不理想，且易产生不良反应[4-5]。研究发现，口腔溃疡的发病机制与局部氧化应激关系密切，氧化-抗氧化系统失衡则不利于溃疡面愈合[6-7]。银杏叶提取物是从银杏叶中分离的成分，包括银杏黄铜、银杏多糖等多种活性成分，具有改善血液循环、降低血压、抗氧化等多种生物学活性[8-10]。本研究通过建立口腔溃疡大鼠模型，观察银杏叶滴剂(提取物)对其的治疗效果，并初步探讨其调控机制。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性SD大鼠，50只，8周龄，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2017-0001，饲养于12 h/12 h明暗交替、温度23～25 ℃、湿度45%～55%的条件下，伦理批号：20200101。

1.2 药物及试剂银杏叶滴剂(德国Dr.Willmar Schwabe药厂，批号：C20201014)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为：A001-1-1、A006-2、A003-3-1)；兔抗鼠酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-2 related factor，Nrf2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)单抗及山羊抗兔IgG抗体(美国SantaCruz公司，批号分别为：SC-25269、SC-28312、SC-17786、SC-51993)；逆转录试剂盒(Takara公司，批号：20190326)；BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo公司，批号：20190452)。

1.3 仪器7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；通用型电泳仪、CheniDoc XRS型化学发光成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立及分组采用化学灼烧法[11]建立口腔溃疡大鼠模型：50只大鼠中随机选取40只用1%的戊巴比妥钠(0.025 g·kg-1)以腹腔注射麻醉大鼠，手术镊夹取直径约1 mm的NaOH晶体在大鼠左侧下唇靠口角黏膜处灼烧30 s，然后用无菌生理盐水冲洗，形成溃疡。将造模成功的大鼠按体质量随机分为模型组、银杏叶滴剂低剂量(25 mg·kg-1)组、银杏叶滴剂中剂量(50 mg·kg-1)组、银杏叶滴剂高剂量(100 mg·kg-1)组，另取10只大鼠仅作麻醉，不进行灼烧造模，作为对照组。连续给药10 d，模型组和对照组大鼠灌胃等量生理盐水。

2.2 溃疡面积测定各组大鼠分别在给药前(0 d)，给药第1天、第3天、第7天，用游标卡尺测量溃疡最大横径(D1)、最大纵径(D2)，计算溃疡面积[12]。

溃疡面积=0.25×π×D1×D2(π=3.14)

2.3 检测溃疡组织中SOD、GSH-Px、MDA水平末次灌胃给药1 h后，脱颈椎处死大鼠，立即取溃疡组织，称其质量，用预冷生理盐水制备质量体积分数为10%的组织匀浆液，于4 ℃、2 800 r·min-1(离心半径为10 cm)离心10 min，取上清液，分别采用黄嘌呤氧化酶法、羟胺比色法、硫代巴比妥酸比色法测定溃疡组织中SOD、GSH-Px、MDA水平。

2.4 检测溃疡组织中TH、Nrf2、HO-1的蛋白表达每组随机取3只大鼠口腔溃疡组织，液氮研磨后转至离心管，加入1×磷酸盐缓冲液匀浆，提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，每个泳道进样 20 μL，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，电转1.5 h至硝酸纤维素膜，封闭2 h，加入一抗摇床孵育过夜(4 ℃)，洗膜后加入二抗，常温孵育2 h，暗室中曝光、显影。扫描拍照后，应用Image J软件进行灰度值分析，以目的蛋白TH、Nrf2、HO-1与内参β-actin的灰度值比值表示其相对表达量。

2.5 检测溃疡组织中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA表达每组随机取3只大鼠的口腔溃疡组织，Trizol法提取溃疡组织中总mRNA，逆转录获得互补链cDNA，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)，反应体系：SYBR Premix Ex Taq 13.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4.5 μL。反应条件：95 ℃ 预变性3 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，重复42个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 大鼠的表观指标40只大鼠全部建模成功，形成直径约3 mm的溃疡，表面附黄白色假膜，边缘充血水肿；模型组大鼠出现毛发暗淡无光泽、活动频繁、易激怒、弓背等表型，给予银杏叶滴剂灌胃干预后，上述情况均得到缓解。

3.2 不同时间点大鼠溃疡面积比较溃疡面积组间、时间、交互比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；干预第0、1天溃疡面积组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，干预第3、7天银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡面积均明显减小(P<0.05)；与银杏叶滴剂低剂量组比较，干预第3、7天银杏叶滴剂中、高剂量组溃疡面积均明显减小(P<0.05)，且银杏叶滴剂高剂量组小于中剂量组；与干预第0天比较，干预第1、3天模型组溃疡面积均无明显变化(P>0.05)，干预第7天其明显减小(P<0.05)；与干预第0天比较，干预第1天银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡面积均无明显变化(P>0.05)；干预第1、3、7天随时间的延长溃疡面积明显减小(P<0.05)。见表2和图1。

表2 不同时间点大鼠的溃疡面积比较

A：模型组；B：银杏叶滴剂低剂量组；C：银杏叶滴剂中剂量组；D：银杏叶滴剂高剂量组

3.3 对大鼠溃疡组织中SOD、GSH-Px、MDA水平的影响与对照组比较，模型组溃疡组织中SOD、GSH-Px 水平均明显降低、MDA水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡组织中SOD、GSH-Px均明显升高、MDA水平明显降低(P<0.05)；与银杏叶滴剂低剂量组比较，银杏叶滴剂中、高剂量组溃疡组织中SOD、GSH-Px均明显升高、MDA水平明显降低(P<0.05)，且银杏叶滴剂高剂量组优于低剂量组。见表3。

表3 对大鼠溃疡组织中SOD、GSH-Px、MDA水平的影响

3.4 对大鼠溃疡组织中TH、Nrf2、HO-1蛋白表达的影响与对照组比较，模型组溃疡组织中TH、Nrf2、HO-1蛋白表达均明显降低(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡组织中TH、Nrf2、HO-1蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与银杏叶滴剂低剂量组比较，银杏叶滴剂中、高剂量组溃疡组织中TH、Nrf2、HO-1蛋白表达均明显升高(P<0.05)，且高剂量的作用效果优于低剂量。见表4和图2。

表4 对溃疡组织中TH、Nrf2、HO-1蛋白表达的影响

图2 Western Blot法测定大鼠溃疡组织HT、Nrf2、HO-1蛋白表达

3.5 对大鼠溃疡组织中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA表达的影响与对照组比较，模型组溃疡组织中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的相对表达均明显降低(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡组织THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的相对表达均明显升高(P<0.05)；与银杏叶滴剂低剂量组比较，银杏叶滴剂中、高剂量组溃疡组织中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA相对表达均明显升高(P<0.05)，且高剂量作用效果显著优于中剂量。见表5。

表5 对溃疡组织中TH mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表达的影响

4 讨论

口腔溃疡的致病机制目前仍不明确。研究认为，其发病与免疫异常、维生素缺乏、遗传改变等多种因素有关[13-15]。西医多通过应用糖皮质激素类药物[16]、免疫调节剂改善症状，虽然短期内可缓解溃疡的症状，但长期服用不良反应较大，且对复发性口腔溃疡较难控制。中医药在治疗口腔溃疡中有一定优势[17-18]。研究表明[19-20]，口腔溃疡病灶部位的损伤不利于口腔黏膜自我修复。故寻找有效药物改善病情有重要临床意义。

本研究采用化学灼烧法建立口腔溃疡大鼠模型，40只大鼠全部建模成功，提示该法模型复制成功率高，且稳定性、重复性好。本研究发现，模型组大鼠出现毛发暗淡无光泽、活动频繁、易激怒、弓背等表现，给予银杏叶滴剂干预后，上述情况均得到缓解，说明银杏叶滴剂可缓解溃疡引起的症状。与模型组比较，干预第3、7天后银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡面积均明显缩小，且呈剂量依赖性；同时银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡面积随干预时间的延长，溃疡面积明显缩小，提示银杏叶滴剂可有效促进大鼠口腔溃疡的愈合。银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡组织中SOD、GSH-Px水平均升高、MDA水平降低，且呈剂量依赖性，说明银杏叶滴剂可有效改善口腔溃疡大鼠氧化应激状态。Bagan等[21]研究表明，活动性口疮性口腔炎患者血清中MDA、GSH-Px 水平升高，与发生口腔溃疡相关。银杏叶滴剂在临床上广泛用于心脑血管疾病防治[22-23]，已有研究证实[24]，银杏叶总黄酮可有效降低脑缺血损伤大鼠脑组织MDA水平、升高SOD、GSH-Px活性，抑制脑内氧化应激反应、减轻脑组织损伤。银杏叶滴剂中含有银杏叶总黄酮等活性物质，给药后，口腔溃疡大鼠溃疡组织内氧化应激反应被有效抑制，从而促进溃疡愈合。

本研究发现，模型组溃疡组织中THmRNA、Nrf2、HO-1mRNA表达均低于对照组，提示大鼠口腔黏膜的发病机制与氧化应激损伤有关；银杏叶滴剂低、中、高剂量组溃疡组织中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的表达均较模型组升高，且呈剂量依赖性，提示银杏叶滴剂可能通过激活溃疡组织内Nrf2/ARE通路促进口腔溃疡恢复。Nrf2是Cap′n′collar调节蛋白家族重要成员，在炎症、糖尿病、肿瘤等多种疾病的病理生理过程中发挥关键作用[25-28]。Nrf2是细胞抗氧化应激关键因子，当机体接收外界刺激信号后，其进入细胞核中，与下游ARE结合从而调控多种抗氧化因子表达，抑制氧化反应[29-31]。Nrf2/ARE通路激活后，其下游内源性保护因子 HO-1 表达增加，从而抑制溃疡病灶的氧化应激反应，减轻口腔黏膜氧化应激损伤[32]。

综上所述，银杏叶滴剂可有效促进大鼠口腔溃疡愈合，可能与激活溃疡组织内Nrf2/ARE通路，改善氧化应激状态有关，这为临床上银杏叶相关药物的开发及用于治疗口腔溃疡提供参考。