鸡IL-15、IL-16和IL-18基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

王远萍，唐涛，吴艳秋，王国镔

摘要：根据GenBank上鸡白介素15（IL-15），白介素16（IL-16），白介素18（IL-18）基因的序列，在保守区设计并合成各自特异引物，并以β-actin基因为内参，采用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量PCR检测方法。将基因克隆至pMD19-T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，鸡IL-15、IL-16、IL-18和β-actin基因的Ct值与标准品稀释度在2×102～2×108copies/μL范围分别呈良好的线性关系，r2均大于0.999。熔解曲线分析表明，产物为特异的单峰。建立的鸡IL-15、IL-16和IL-18基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在mRNA水平对鸡白介素的定量分析奠定了基础。

关键词：实时荧光定量PCR；鸡；IL-15；IL-16；IL-18

细胞因子是多种细胞所分泌能调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合等小分子多肽的统称[1]。对于人细胞因子已经有较广泛的研究，现已有大量纯化的细胞因子在临床上用于治疗多种疾病，禽细胞因子的研究远远落后于人细胞因子的研究[2]。近年来，人们主要是研究鸡细胞因子的佐剂效应，很少研究细胞因子差异表达与疾病之间的关系。本研究主要是建立一种检测细胞因子表达的快速灵敏的方法，为细胞因子差异表达与疾病之间关系的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验动物、菌种和质粒

试验动物为21日龄非免疫鸡，DH5α基因工程菌株，pMD19-T载体。

1.2主要仪器

实时荧光定量PCR仪，普通PCR仪，凝胶成像系统，电泳仪，核酸蛋白测定仪，高速冷冻离心机，超净工作台，电热恒温培养箱。

1.3主要试剂

TRNzol-A+总RNA提取试剂，Master Mix，Real MasterMix SYBR GreenⅠ，质粒小量提取试剂盒，反转录酶Prime Script，PCR产物回收试剂盒。

1.4引物的设计及合成

参照GenBank上登录的细胞因子IL-15、IL-16、IL-18以及β-actin的核酸序列，用Primer Premier 5.0设计引物。引物序列见表1。

1.5 RNA的提取与反转录

1.6实时荧光定量PCR及熔解曲线的绘制

采用SYBR Green I染料法，在Bio-Rad iCyclerQ5荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析[3]。PCR反应体系为：cDNA模板1μL，2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution 9μL，上游引物终浓度为0.2μmol/L，下游引物终浓度为0.2μmol/L；补足超纯水至20μL。PCR反应程序如下：①95℃预变性1min；②95℃变性15s，55.0℃复性25s，延伸10s；反应45循环。PCR仪于延伸阶段采集荧光信号；③95℃变性3min，50℃复性3min；④65℃起始至95℃停止梯度升温绘制熔解曲线，每梯度上升0.5℃，每梯度采集荧光信号一次。绘制溶解曲线进行特异性分析。

1.7循环条件的优化

温度条件的优化：分别使用64.0、63.1、61.5、58.9、55.3、52.8、51.1和50.0℃八个温度梯度对Real-time PCR反应退火温度进行优化。

引物浓度的优化：分别使用终浓度0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3μmol/L六个引物浓度梯度对Real-time PCR反应引物浓度进行优化。反应过后通过Ct值的大小以及熔解曲线的特异性判断最佳退火温度以及最适宜引物浓度[4]。

1.8标准曲线的绘制

将IL-15、IL-16、IL-18以及β-actin PCR扩增产物进行胶回收，回收的片段与pMD19-T载体连接、转化DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆。将测序鉴定正确的阳性克隆质粒标准品稀释100倍后，使用核酸蛋白测定仪Bio-Rad Smartspec3000进行质粒标准品OD260的测定，并根据公式转化为测定样品中的质粒拷贝数。将浓度为2×108的质粒标准品进行10倍梯度稀释，共6个梯度，拷贝数范围为2×108～2×103copies/μL。每个稀释度设3个平行，在优化好的反应条件下进行实时荧光定量PCR反应，根据各稀释度Ct值得出检测范围，并绘制标准曲线。

2结果

2.1特异性分析

根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（见图1）和实时荧光定量PCR熔解曲线分析表明，PCR扩增特异性很强，只有1个特异性峰，无引物二聚体及非特异性扩增产物出现。PCR扩增的目的条带长度符合预期大小。

2.2实时荧光定量PCR的优化条件

退火温度及引物浓度的优化结果显示，用表2中的PCR反应条件，具有最低的Ct值及最高的荧光强度，且无引物二聚体形成。

2.3标准曲线的绘制

将各细胞因子阳性质粒按体积比1：10倍比稀釋后作为PCR定量模板，根据各稀释度Ct值得出检测范围，并绘制了标准曲线。结果表明，该方法具有良好的敏感性，检测下限均为2×102copies/μL，且Ct值与其浓度在2×108～2×102copies/μL范围内呈现良好的线性关系，r2>0.999。

3讨论

有关细胞因子方面的研究已成为当今基础免疫学和临床免疫学研究中十分活跃的领域，并取得了令人瞩目的成绩。实时荧光定量RT-PCR是检测微量mRNA较准确的方法，特异性和敏感性高，故本试验选择此方法。由于提取RNA的质量差异以及反转率效率上的差异，因此应选择内参基因进行校正和标准化[5]。β-actin基因序列高度保守，mRNA表达数量高，能在不同的组织细胞中稳定表达。故本文选择β-actin作为建立检测细胞因子基因的内参基因。本文建立的鸡IL-15、IL-16和IL-18基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在mRNA水平对鸡白介素的定量分析奠定了基础。█

参考文献：

[1]刘英姿，罗有梁，周铁忠.原花青素A-1调节ConA刺激小鼠脾细胞分泌Th1/Th2细胞因子的影响[J].免疫学杂志，2012，28 （11）： 942-945.

[2]陶新，汪以真.细胞因子在动物营养中的研究进展[J].饲料研究，2001（7）：12-13+11.

[3]张贺楠，赖汉漳，齐岩，等.鸡IFN-α和IFN-β及IFN-γ基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2009，39（2）： 173-177.

[4]刘温泉.新城疫F48E9毒株与Lasota毒株感染鸡后外周血部分细胞因子差异表达的研究[D].四川农业大学，2010.

[5]王玉林，史进方，蔡惠芬，等.内参基因β-actin质粒标准品的构建[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（48）：9501-9504.