新疆野生北山羊小反刍兽疫病毒分子特征

汪 萍，夏 俊，王 文，马晓艳，吴晓东，苗书魁，马文戈，黄忠武，魏玉荣，陆桂丽，沙依兰·卡依扎，米晓云，黄 炯

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所，动物临床医学研究中心，新疆乌鲁木齐 830013；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830013；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；4.阿克苏地区库车县兽医站，新疆库车 843000）

小 反 刍 兽 疫（peste des petits ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征[1]。绵羊、山羊、小反刍类野生动物均对PPRV 易感。牛、水牛、骆驼、猪也可感染PPRV，但除骆驼外很少表现临床症状[2]。部分易感野生动物以及牛、猪等家养动物感染PPRV 后不发病，但体内可持续隐性带毒，这为PPR 防控带来潜在威胁。自2013 年新疆霍城县发生PPR 以来，2014—2016 年新疆鄯善、博乐、库车、乌鲁木齐等地的野生北山羊、盘羊、瞪羚也出现PPRV感染引起的死亡[3]。2017 年，新疆阿克苏地区发现2 只野生北山羊死于PPRV 感染。由野生动物感染PPRV 的报道可见，PPRV 不但对野生动物濒危物种的生存构成严重威胁，还因野生动物中PPRV的持续存在，影响PPR 全球根除计划的完成。因此，除对家养动物进行疫苗免疫外，还需要持续加强对野生动物感染PPRV 的关注。研究我国野生动物的PPRV 分子生物学特征，可为制定系统、全面、有效的PPR 防疫策略提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

2017 年1 月，新疆阿克苏地区2 只野生北山羊异常死亡，临床症状疑似PPRV 感染。采集肺和淋巴结，将组织研磨，冻融3 次后12 000 r/min 离心20 min，取上清提取RNA。RNA 提取试剂盒，QIAGEN 公司产品；One step RT-PCR kit，Takara 公司产品；DNA凝胶回收试剂盒，AXYGEN公司产品。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank 公布的PPRV 基因组序列，设计14 对寡核苷酸引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒RNA 提取和RT-PCR

按QIAGEN RNeasy MINI Kit 说明书提取病毒RNA，取5 μL 提取的RNA 于50 μL 反应体系进行RT-PCR 反应（Takara One step RT-PCR kit）。反应条件如下：50 ℃，30 min 进行反转录；94 ℃，2 min 进行Taq酶激活；30 个循环的PCR（94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）；72 ℃，10 min 延伸。

1.4 序列测定

将RT-PCR 鉴定为阳性的产物，命名为China/XJAKS/2017。按AXYGEN DNA 凝胶回收试剂盒说明书步骤进行胶回收。将PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 基因组和系统发育分析

用DNAstar 4.0 软 件 和Clustal W 方 法，对China/XJAKS/2017 的全基因组序列和推导的氨基酸序列进行比较，并与其他具有代表性的PPRV 株进行比较。基于全长基因组，N基因核苷酸序列进行系统发育分析，采用MEGA 5.0 软件，确定PPRV 的进化趋势。

2 结果

2.1 RT-PCR

用14 对PPRV 特异性引物进行RT-PCR，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得14个基因片段（图1）。

2.2 China/XJAKS/2017 基因组长度及特点

图1 China/XJAKS/2017 株RT-PCR 产物电泳结果

利用DNAstar 4.0 软件，将分段获取的China/XJAKS/2017 基因序列拼接，得到的基因组全长 为15 954 nt，与GenBank 上 公 布 的China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015、CH/HNZM/2014、CH/HNNY/2014、China/BJ/2014、CH/GDDG/2014这6 个毒株的全基因组序列长度完全一致。而与全基因组长度为15 948 nt 的 Nigeria 75/1、ICV89、Oman 1983 等国外分离毒株基因组长度不同，多出了6 nt。与其他参考毒株相比，China/XJAKS/2017第4 828 位点有1 个碱基（C）缺失，第5 214 位点有1 个碱基（C）插入。突变和缺失主要集中在基因组的第4 500～5 224 位（图2～3）。

2.3 China/XJAKS/2017 与其他PPRV 毒株的基因同源性比较

通过全基因组比对发现，China/XJAKS/2017与同为基因IV 型的中国分离株同源率高，尤其和2 个新疆分离株（China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015）同源率最高，分别达99.6%、99.0%。与基因I 型和III 型毒株的同源率低，为87.0%～90.2%，其中与KN5/2011 同源率最低，为87.0%（图4）。

China/XJAKS/2017 与2 个新疆分离株（China/XJBZ/2015、China/XJYL/2013）、1 个西藏分离株（China/Tibet/2007）、2 个疫苗株（Sungri/96、Nigeria/75/1）进行同源性比较发现：3'UTR、N、P、V、C、M、F、H、L、5'UTR 的全长基因组同源性分别为92.5%～99.1%、93.4%～99.8%、92.7%～99.5%、93.3%～99.2%、92.3%～99.1%、93.8%～99.80%、92.9%～100%、91.1%～99.3%、93.6%～99.5%、91.7%～100% 和92.1%～99.6%。氨基酸水平上，L 蛋白和N 蛋白保守性最高，分别为97.0%～99.4%和94.5%～99.6%；非结构蛋白V 蛋白和C 蛋白的保守性最低，分别为87.9%～98.7%和88.8%～98.3%。作为病毒感染细胞和诱导中和抗体最重要的F 蛋白和H 蛋白，China/XJAKS/2017与基因II 型疫苗株Nigeria/75/1 的同源率分别为96.5%和92.5%（表1）。

图2 China/XJAKS/2017 与各参考毒株全基因比较结果

图3 China/XJAKS/2017 与各参考毒株基因序列比对结果

表1 China/XJAKS/2017 与新疆分离株、西藏株、疫苗株等的同源性 %

图4 China/XJAKS/2017 与参考毒株全基因同源性分析结果

2.4 China/XJAKS/2017 的系统进化分析

为确定China/XJAKS/2017 的分类地位，分别以不同地区、不同年代及不同基因型的PPRV 毒株N基因和全基因序列为基础绘制了进化树。N基因进化分析结果（图5）显示：China/XJAKS/2017 属于基因IV 系；在N基因核酸序列水平上，China/XJAKS/2017 与除西藏地区分离毒株外的其余中国分离株亲缘关系最近，同在一个小的分支；与国外毒株相比，则与邻国巴基斯坦和塔吉克斯坦分离毒株亲缘关系最近。全长基因组系统进化分析结果（图6）显示，在全基因核酸序列水平上，China/XJAKS/2017 同样与除西藏以外的国内其他分离株遗传距离最近，共同形成一个小分支，而西藏分离株则与印度分离株亲缘关系最近。

图5 基于N 基因序列的系统进化分析结果

图6 基于全长基因组的系统进化分析结果

3 讨论

PPRV 分子生物特征显示，China/XJAKS/2017比Nigeria 75/1、ICV89、Oman 1983 等 国 外分离毒株的全基因组长度多了6 nt，与China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015、CH/HNZM/2014、CH/HNNY/2014、China/BJ/2014、CH/GDDG/2014这6 个毒株不仅基因组长度相同，而且在M 和F蛋白之间的第5 222～5 227 位比其他毒株多出6 nt，但这并没有影响结构蛋白和非结构蛋白的大小。核苷酸同源性分析表明，China/XJAKS/2017与China/XJYL/2013 全基因核苷酸同源性为99.6%。由此可见，自2013 年新疆发生PPR 以来，随着时间的推移，PPRV 有从新疆西北部向南传播的态势。China/XJAKS/2017 虽然出现了个别位点的缺失或插入，但与China/XJYL/2013 相比，变异程度较低。

通过遗传进化分析可以看出，China/XJAKS/2017 与国内毒株特别是新疆本地分离的PPRV 毒株最相似。与国外毒株相比，与巴基斯坦和塔吉克斯坦分离的PPRV 毒株最相似[4-5]。因此，分析PPRV 的分子生物学特点对于病毒溯源有一定参考意义。

China/XJAKS/2017 与疫苗株Nigeria/75/1 的H蛋白同源性为92.5%。而H蛋白是诱导产生中和抗体的蛋白[6-7]。目前商品化PPR 活疫苗（Nigeria75株或sungri96 株）被认为能保护所有基因谱系[8]。我国PPRV 基本属于基因IV 型。2007 年以来，基因II 型的Nigeria75 株作为疫苗株在我国应用，免疫效果良好[9]。但疫苗接种后的保护水平还受疫苗株和田间毒株抗原差异的影响，因此各地发病率也不同，我国有的地区已经达到免疫无疫，但有的地区还呈现点状散发。另外，自然环境中存在不同宿主来源的病毒，如野生动物以及带毒的非易感家养动物、康复动物或疫苗接种动物。它们在病毒进化过程中的作用机制尚不清楚，因此要达到消除PPRV 的目标，除对家养动物免疫外，还需对不同宿主来源的病毒进行分子流行病学研究。

新疆地理位置特殊，与俄罗斯、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、巴基斯坦、蒙古国、印度、阿富汗接壤。而阿富汗、印度、塔吉克斯坦和巴基斯坦等国家的PPR 疫情常年呈地方性暴发流行。近年来，新疆与哈萨克斯坦、蒙古国接壤的地区发生了北山羊、盘羊、瞪羚感染PPRV 引起死亡的事件。PPR 作为一种自然流行疾病，将长期存在于野生动物中，并相互传播[10-11]。这不但对濒危野生小反刍动物造成威胁，可能在野生动物之间、野生动物与牲畜之间传播，这为我国消除PPR 带来困难。综上所述，新疆PPR 防控形势依然严峻，需加强我国边疆地区PPR 免疫隔离带建设，并对野生动物感染的PPRV分子流行病学特点进行追踪监测。