柚皮素酰腙类衍生物的合成、体外抗氧化活性以及细胞毒性研究

董家吏，廖岳婷，焦必宁，苏学素

1西南大学化学化工学院，重庆 400715；2中国农业科学院柑桔研究所(西南大学柑桔研究所)农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室，重庆 400712

黄酮类化合物是一类在植物界普遍存在的天然苯并-γ-吡喃酮衍生物，具有抗菌[1]、抗氧化[2]、免疫调节，化学预防和抗癌特性[3]，对人体健康大有益处。柚皮素作为一种二氢黄酮类化合物，也具有抗菌[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6,7]等生物活性。Tutunchi和Filippin等[8,9]研究了柚皮素抗击COVID-19的可行性机制。柚皮素可与Vc、Ve联用能更有效的治疗镉诱导和砷诱导的Wistar大鼠的氧化应激引起的肝损伤[10,11]。但由于柚皮素自身的脂溶性和水溶性都较差，导致其生物利用率不高。因此柚皮素的改性研究受到各界的广泛关注。

柚皮素的7位、4′位的酚羟基，以及4位的羰基较为活泼，因此可以通过化学反应修饰柚皮素的结构，改善其水溶性进而改善其生物利用率。据文献报道，酰肼类化合物具有良好的抗氧化活性[12,13]、抗菌活性[14]、抗癌活性[15]等，但由于酰肼中氨基的影响，对有机体有一定的毒性，因此将酰肼通过改造得到酰腙是改善酰肼毒性的有效手段[14]。酰腙类化合物同样具有良好的抗菌[16-18]、抗氧化[19,20]、抗增殖[21]等。因此，在现有关构效关系以及柚皮素改性研究的基础上，本文在4位引进酰肼基团形成酰腙，期望能得到既有生物活性，又能降低酰肼结构毒性的柚皮素衍生物。对所得衍生物进行体外抗氧化活性，以及其对HEK293细胞的细胞毒性实验，以筛选高抗氧化活性及低毒性物质，为进一步的开发利用提供参考。

图1 柚皮素的结构

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂

柚皮素标准品(纯度≥98%，源叶生物)；肼基甲酸苄酯(毕得医药)；2-氯苯甲酰肼(Aladdin)；2-硝基苯酰肼(Macklin)；苯乙酸肼(源叶生物)；3-甲氧基苯酰肼(HAWN)；4-氨基苯甲酰肼(源叶生物)；2-呋喃苯甲酰肼(毕得医药)；戊酰肼(毕得医药)；3-溴苯甲酰肼(源叶生物)；3-羟基苯甲酰肼(Alfa Aesar)；烟酰肼(Adamas-beta)；2-溴苯甲酰腙(Macklin)；2，4-二羟基苯甲酰肼(Macklin)；无水乙醇(HPLC，Knowles)；乙酸(AR)；乙酸乙酯(AR，成都市克隆化学品有限公司)；石油醚(AR，成都市克隆化学品有限公司)；硅胶；DMF(AR，重庆川东化工有限公司)；DMSO(Merck)；血清(康源生物)；双抗(Gibco)去离子水。

具有快速ABTS[2，2′-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)](S0121)和FRAP[血浆铁还原能力](S0116)检测能力的试剂盒购自Beyotime biotechnology company(上海，中国)；DPPH[1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基]自由基清除能力试剂盒(G0128W)；CCK-8试剂盒(abbkine)；HEK293细胞(珠海凯瑞生物科技有限公司)。

1.1.2 实验仪器

RE-52AA旋蒸仪(上海亚荣生化仪器厂)；SZCL-3A磁力搅拌器(郑州科泰实验设备有限公司)；M1-L213C微波炉(美的)3020-352酶标仪(Thermo fisher scientific)；SGWX-4显微熔点仪(仪电物光)；TGL-16c台式离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(AIRTECH)；CO2培养箱(Thermo)；D1008E掌上离心机(SCILOGEX)；96孔板(NEST)。

1.2 柚皮素酰腙类衍生物的合成方法

衍生物a～f、h～m的合成方法。取1.5 mmol柚皮素和1.5 mmol酰肼类化合物于圆底烧瓶中，加入20 mL乙醇，2 mL乙酸溶解。将混合溶液在700 W微波炉中加热4～5 min，TLC跟踪反应。由于4-氨基苯酰肼与柚皮素微波加热不反应，因此衍生物g的合成方法为称取1.5 mmol柚皮素和1.5 mmol 4-氨基苯酰肼类化合物于圆底烧瓶中，加入20 mL乙醇，2 mL乙酸溶解。将混合溶液在110 ℃回流8～12 h，TLC跟踪反应。薄层色谱显示混合物中除反应物以外，有产物点，说明有新化合物生成。反应所得混合物用乙酸乙酯和石油醚作洗脱液分离，或用无水乙醇重结晶，得到衍生物纯品。通过1H NMR及HR-EI-MS等方法确定衍生物结构。化合物的合成路线如图2所示。

图2 13种衍生物合成路线及结构

1.3 体外抗氧化活性的测定

1.3.1 ABTS法测定体外抗氧化活性

参考Hua等[22]的方法对柚皮素衍生物以及BHT、BHA两种食品添加的抗氧化剂进行了抗氧化活性测定。将所有样品取0.01 mmol，溶于10 mL DMF得到1 mM的溶液，备用。将试剂盒中的10 mM的Trolox溶液稀释为1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15 mM。使用具有ABTS检测功能的总抗氧化剂含量测定试剂盒，确定总抗氧化剂活性。96孔板中每个检测孔中加入20 μL过氧化物酶工作液，空白对照孔中加入10 μL蒸馏水；标准曲线检测孔加入10 μL各种浓度的Trolox溶液，样品检测孔加入10 μL各种样品溶液。每个孔再加入170 μL ABTS工作液，轻轻混匀，在室温孵育6 min，在414 nm的波长下检测其吸光度。每个样品3个复孔，结果取平均值。

标准曲线：

△A414=A414空白-A414标准

样品：

△A414=A414空白-A414标准

1.3.2 FRAP法测定体外抗氧化活性

称取0.01 mmol化合物，溶于5 mL DMF，再加入5 mL去离子水得到1 mM的溶液，备用。称取2.78 mg FeSO4·7H2O用DMF∶H2O=1∶1溶解至1 mL，得到10 mM的溶液。用DMF∶H2O=1∶1的混合溶剂稀释为1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15 mM的溶液备用。96孔板的每个检测孔中加入180 μL FRAP工作液；空白对照加入5μL 1∶1的DMF和H2O的混合溶剂；标准曲线检测孔加入5 μL不同浓度的FeSO4·7H2O溶液；样品检测孔中加入5 μL样品溶液；37 ℃ 孵育3～5 min后在593 nm波长下测定吸光度。每个样品3个复孔，结果取平均值。

1.3.3 DPPH自由基清除能力测定

称取化合物2 mg溶于10 mL DMF中，得到200 μg/mL的药液，备用。用甲醇配制500 μg/mL的Trolox溶液。再用甲醇将标准品按0、5、10、15、20、25 μg/mL的浓度梯度稀释，备用。将各种药液用80%甲醇水，稀释至20 μg/mL，分别吸取药物稀释液150 μL于1.5 mL离心管中，再加入150 μL DPPH工作液，避光反应30 min后，吸取反应液200 μL于96孔板中，测定517 nm波长的吸光度。每个样品做3个复孔，结果取平均值。

化合物自由基清除率的计算：

化合物的自由基清除能力是于Trolox的浓度(μg/mL)来评估：

自由基清除率=0.351×(清除率-0.708 4)

1.4 细胞毒性测定

本实验所用细胞为HEK293细胞，实验前需先做预实验。在96孔板中加100 μL细胞密度分别为1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、1×104的三组HEK293细胞，以及一个空白对照，一共63个孔。然后将板放在37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h。再向96孔板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液。在培养箱中将平板孵育1～4 h，并每隔1 h使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。结果显示当293细胞数量为1×104细胞/孔、孵育时间为2.5 h，吸光值的结果接近1.0，符合预期。因此，选取的最佳细胞数量为1×104细胞/孔，孵育的最佳时间为2.5 h。

正式实验，在96孔板中的加100 μL 1×104细胞/孔293细胞悬液，将板在37 ℃，5%CO2培养箱中预培养24 h，在平板中加入培养基稀释过的不同浓度的待测药物。每种药物的浓度梯度设置为：0、25、50、100、250、500 μmol/L、空白对照(不含细胞的培养液)、阴性对照(DMSO终浓度为1%)，每个浓度做3个复孔。药物用DMSO溶解，其中DMSO终浓度为1%。在培养箱中孵育48 h，向96孔板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液。在培养箱中将平板孵育80 min。使用酶标仪测量450 nm波长的吸光度。

细胞存活率的计算：

2 结果与分析

2.1 化合物表征结果

2.2 抗氧化活性

由图3、4、5可得，合成的13种衍生物对ABTS、FRAP、DPPH三种自由基的清除能力均强于柚皮素。结合三种测试方法，8种衍生物b、e、g、i、j、k、l、m的抗氧化活性显著强于柚皮素。并且g、k两种衍生物在三种方法下均表现出强的抗氧化活性，与BHT的抗氧化活性接近。

图3 BHT、BHA、柚皮素和13种衍生物对ABTS自由基的清除能力

图4 BHT、BHA、柚皮素和13种衍生物对FRAP自由基的清除能力

图5 BHT、BHA、柚皮素和13种衍生物对DPPH自由基的清除能力

2.3 黄酮类化合物的抗氧化活性构效关系分析

黄酮类化合物的抗氧化活性与黄酮环上的羟基密切相关，柚皮素5位、7位和4′位的酚羟基是其抗氧化活性的活性基团，本文所得的13种衍生物抗氧化活性均强于柚皮素，推测其构效关系如下：(1)合成的衍生物都具有酰腙结构，酰腙结构具有良好的抗氧化活性[20]，合成的衍生物抗氧化活性均强于柚皮素；(2)体外抗氧化活性测定显示，f的自由基清除能力弱于其余衍生物，推测原因是f酰基所连基团为烷基，只有较弱的超共轭效应，其余衍生物酰基所连基团为苯环，具有一定程度的共轭作用。此外，若酰基未直接与苯环相连(如a、d)，自由基清除能力也相对较弱。推测原因是参与共轭的原子数目有限；(3)苯环连接的给电子基团使得生成的自由基更稳定，因此，当苯环连接给电子基团时，苯环上电子云密度增加，自由基的稳定性增加，因此衍生物j～m的抗氧化活性较c更强；(4)化合物中酚羟基的个数显著影响其抗氧化活性[23]，衍生物k、l的抗氧化活性明显强于柚皮素，因k含有5个酚羟基，其抗氧化活性强于其他化合物；(5)由图3、4、5的结果显示，衍生物g与b、h、i等衍生物相比，抗氧化活性相对较好，因其修饰基团的苯环上具有给电子基团氨基，使其抗氧化活性增强；(6)ABTS、FRAP、DPPH三种体外抗氧化活性测定结果都显示h与i相比，i的自由基清除能力较强，因此，对于单取代的溴原子，间位具有较弱的诱导效应，因而较邻位有更强的抗氧化活性。

2.4 细胞毒性结果

综上所述，8种衍生物的抗氧化活性显著强于柚皮素，具有很好的研究前景。因此测定了柚皮素和8种衍生物对于HEK293细胞的细胞毒性。各衍生物在不同浓度下，HEK293细胞存活率如表1所示，各衍生物的IC50结果如图2所示。

表1 不同浓度柚皮素和衍生物对于HEK293细胞存活率的影响

检测结果显示，在0～500 μmol/L 的范围内，HEK293细胞存活率均随衍生物浓度的增大而减小，具有一定的剂量效应关系。本实验条件下细胞存活率大于90%，可认为衍生物对细胞无抑制[24]。由表1可得，除e、m外，其余衍生物在0～25 μmol/L的浓度范围内细胞无抑制作用；g、k、l在0～50 μmol/L浓度范围内，细胞存活率大于90%，可以认为这3种化合物在0～50 μmol/L的范围内对HEK293细胞无抑制作用；j在0～100 μmol/L浓度范围内时，细胞存活率仍大于90%。而柚皮素在0～250 μmol/L的浓度范围内细胞存活率仍在90%以上，比8种衍生物的细胞毒性都要低。图6为柚皮素和8种化合物的IC50值，结果显示，衍生物j在相同条件下，对HEK293细胞的毒性较小，并且毒性与柚皮素最为接近，衍生物g、k、l三种衍生物对HEK293细胞的毒性次之。

图6 柚皮素和8种衍生物作用HEK293细胞的IC50

3 结论

本实验利用微波辅助的方式合成了13种柚皮素酰腙类衍生物，其中有12种未被文献报道。通过ABTS、FRAP、DPPH三种方法测定了13种衍生物的体外抗氧化活性。所得衍生物抗氧化活性均强于柚皮素。且8种衍生物b、e、g、i、j、k、l、m的抗氧化活性效果尤为显著，且g、i、j、k、l、m等衍生物的抗氧化活性与BHT相当，说明柚皮素4位羰基通过反应引入酰腙基团能有效提高母体的抗氧化活性。对衍生物抗氧化活性进行了构效关系分析，显示当R基团为吸电子基团时，衍生物电荷密度分散，反应所得的自由基中间体稳定性增加，导致其抗氧化活性强于柚皮素本身。活性较强的8种衍生物对HEK293细胞存活率的影响结果显示，除e、m外，其余衍生物在0～25 μmol/L的浓度范围内对HEK293表现为无毒。衍生物j对细胞无毒的浓度范围在0～100 μmol/L，而衍生物g、k的检测结果显示，浓度为0～50 μmol/L的范围内，仍有大量细胞存活。但所得衍生物的细胞毒性均强于柚皮素，可见在引入酰腙基团增加抗氧化活性的同时，还是不同层度的增加了化合物的细胞毒性。这为各衍生物后续研究中的添加剂量提供了参考依据。因此，经过初筛，衍生物g、j、k拥有良好的抗氧化活性，并且细胞毒性较小，其中衍生物j既具有较强的抗氧化活性，又有较低的细胞毒性，具有一定的应用前景。为进一步开发研究提供了依据。对13种衍生物抗氧化活性的构效关系分析，为以后的合成设计提供了方向。