鸡骨常山根中的一个新吲哚生物碱

赖 奇，段云凤，马燕华，杨春菊，庄 敏，吕 典，尹俊林，曾广智

云南民族大学民族医药学院 民族药资源化学国家民委教育部重点实验室，昆明 650500

夹竹桃科(Apocynaceae)是热带区植物主要类型之一，全世界大约有250属，2 000余种，广泛分布在亚热带与热带地区。鸡骨常山(AlstoniayunnanensisDiels)为夹竹桃科鸡骨常山属直立灌木。该属植物还有大叶糖胶树，岩生羊角棉，糖胶树，黄花羊角棉，羊角棉[1]。其中鸡骨常山为中国特有种，主要分布于云南省[2]，贵州省，广西等地。民间常用其根治头痛、发热、降压，外用具有消肿的作用。鸡骨常山化学成分主要为单吲哚类生物碱，如利血平、蛇根精、霹雳萝芙因等[3-7]。宫颈癌为威胁女性健康的重要疾病，是人类面临的重大公共安全卫生问题[8]。天然产物中不乏抗肿瘤药物的明星分子，如紫杉醇类、长春花类化合物[9]。本课题组，在前期的调查研究中发现，鸡骨常山根的总碱具有一定的抗肿瘤作用[10,11]，为了从中发掘活性较好的单体化合物，我们对鸡骨常山的根部开展了化学成分研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器和试剂

核磁共振仪BrukerAV400MHz(Bruker，美国)；1810傅里叶(KBr压片)变换红外光谱仪(尼高力，美国)；X-4显微熔点测试仪(巩义市予华仪器有限责任公司，中国)；Autopol V plus鲁道夫高精度旋光仪(鲁道夫，美国)；Sephadex LH-20凝胶柱色谱(GE Healthcare，美国)；柱色谱级使用硅胶(100～200、200～300、300～400目)及GF254 薄层色谱硅胶板(青岛海洋化工厂，中国)；Waters AutoSpec Premier P776高分辨磁质谱仪(Waters，美国)；提取和分离过程中所涉及到的化学试剂均为分析纯(上海科技股份有限公司，中国)。Thermo Scientific 3425二氧化碳细胞培养箱(Thermo Scientific，美国)；Molecular devices Spectra Maxi3x 型酶标仪(Molecular devices，美国)，Agilent 6420 三重四极杆LC-MS(Agilent，美国)；DMEM高糖完全培养基、胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺Glutamine均购买于(Biological Industries，以色列)；磺罗丹明B(SRB)(上海阿拉丁试剂有限公司，中国)。

1.2 材料

药材鸡骨常山产自云南临沧市永德县，经昆明采智公司采集植物样品并进行鉴定，植物标本保存于云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室。细胞Hela(人宫颈癌细胞)源至于中国科学院的上海细胞库。

2 实验方法

2.1 提取与分离

干燥的鸡骨常山根2.91 kg，经过粉碎加工后，用95%工业甲醇冷浸提取3次。将3次甲醇提取液通过减压浓缩合并，得到根部的浸膏为150 g。将该浸膏混悬于适量的水中，先用适量分析纯石油醚萃取得到石油醚部分15 g，后用冰醋酸将混悬液体调至pH为3～4，使用分析纯的乙酸乙酯萃取得到A部分32 g，再用氨水将萃取后的混悬液调至pH为10左右，分析纯乙酸乙酯萃取得到B部分为7.2 g。将B部分用60～100目硅胶50 g拌样然后进行硅胶柱正向柱色谱，洗脱剂的梯度系统为石油醚-乙酸乙酯(50∶1)至纯乙酸乙酯再到二氯甲烷-甲醇(50∶1)到纯甲醇，TLC检测后合并极性大概相同组分，合并后得到了5个组分，分别标记为Fr.1～Fr.5。取Fr.1部分(1.2 g)用正相硅胶柱进行色谱分离，按照石油醚-乙酸乙酯(30∶1→10∶1)作为流动相梯度洗脱，每200 mL一个馏分，经TLC检测后合并展板位置相同组分，得到化合物2(120 mg)。Fr.2经正相硅胶柱及Sephadex LH-20色谱分离，再进一步经硅胶柱色谱柱分离纯化得化合物5(100 mg)。Fr.3部分纯甲醇溶解经纯甲醇体系凝胶分离后，再用硅胶柱色谱分离，流动相为乙酸乙酯，得化合物3(400 mg)。Fr.4部分用硅胶色谱分离，流动相为氯甲(50∶1→10∶1)，再经过HPLC甲醇-水(50∶50→40∶60)30 min得到化合物1(23 mg)和化合物4(12 mg)，见图1。

图1 鸡骨常山中分离得到的化合物

2.2 抗肿瘤活性筛选

选择对数生长期的Hela细胞，用含10% FBS的DMEM培养基制成悬液，每孔5 000细胞均匀接种于96孔板板中，每孔体积100 μL，培养24 h至细胞完全贴壁。将分离得到的化合物用DMSO配置成10 mM的储备液，细胞贴壁后每孔加入相应浓度待测化合物继续培养48 h。完成培养后，每孔添加20%三氯乙酸25 μL在4 ℃冰箱固定1 h，去除固定液，室温1%磺酰罗丹明B(SRB)染色1 h，1%醋酸清洗96孔板4次，自然风干24 h后每孔添加10mM的Tris溶液100 μL至完全溶解，然后在多功能酶标仪490～520 nm波长处检测其OD值，并用GraphPad Prism 8对数据进行统计分析，并作出图表。实验独立重复3次，每组6个副孔。

3 实验结果

3.1 化合物结构鉴定

化合物1白色固体(甲醇)，HR-ESI-MS：m/z352.201 9[M+H]+(calcd for C21H26N3O2，352.202 0)，推测该化合物分子式为C21H25N3O2，不饱和度为11；熔点为278～282 ℃；旋光度为0。IR(KBr)：3 413、2 361、1 638、1 618、1 400、1 262、1 121、1 067、953、617、515 cm-1；红外光谱显示该化合物含有氨基(3 413 cm-1)和酯羰基官能团(1 638 cm-1)，吲哚环(1 618、1 400 cm-1)。化合物1的13C NMR和DEPT谱显示该物质含有21个碳，分别为2个甲基(其中一个为乙酰基上的甲基δ22.8，一个末端甲基信号δ12.9)，3个亚甲基(δ28.3、34.6、56.5)，10个次甲基(δ28.6、46.8、51.5、57.0、76.6、111.9、118.3、118.7、119.8、122.1)，6个季碳(δ104.2、128.7、130.3、135.0、138.6、173.3)。化合物1与文献报道的vellosiminol[12]相比较，两者波谱数据极为相似，具有单萜吲哚生物碱的特征，推测该化合物为一个具有(5、15)桥环单萜吲哚生物碱；这两个化合物不同之处在于∶化合物1在C-17上连接有一个乙酰基(δ173.3、22.8)和一个氨基(IR：3 413 cm-1)，根据Scifinder检索，推测该化合物为新的单萜吲哚生物碱。由于提取分离过程中使用了氨水和乙酸，同时天然产物中氮氧杂缩醛类化合物较少[13,14]，因此推测化合物1可能为分离过程中化合物5和氨水乙酸反应得到的产物。

表1 化合物1的NMR数据(400 MHz，CDCl3)

在化合物1的1H-1HCOSY谱中(图2)，H3-18与H-19相关说明C-18与C-19相连接；H-17与H-16相关说明C-17和C-16相连。而H2-14与H-3和H-15相关，说明C-3，C-14和C-15彼此相连。H-5与H2-6相关，说明C-5与C-6相连。H-16与H-5和H-15相关，说明C-16与C-15和C-5相连。在化合物1的HMBC谱中(图2)，H3-18(δ1.5)甲基质子信号与季碳C-20(δ135.0)和C-19(δ118.3)信号相关，说明C-18与C-19和C-20彼此相连接；H3-2′(δ1.5)甲基质子信号和羰基碳C-1′(δ173.3)信号相关，说明C-2′和C-1′相连接。H-17(δ5.0)信号与C-1′(δ173.3)信号相关，说明C-17通过氧原子与C-1′相连。H-17(δ5.0)信号还与C-16(δ46.8)信号相关说明C-17和C-16相连。H-9(δ7.4)信号与次甲基信号C-8(δ138.6)、C-7(δ104.2)信号相关，所以C-9和C-8相连，C-8和C-7相连。为了确定化合物1相对立体构型，测定了化合物1的NOESY相关图谱(图2)，在化合物1的NOESY相关图谱(图2)中，H-3与H-15相关，H-3与H-16相关，H-16与H-15相关，说明这些质子朝向相同，定义为β构型，H-5和H-15或H-3无直接相关，因此H-5朝向定义为α构型，这种结构，环系张力最小。H-19的耦合常数为6.7，化合物vellosiminol[12]耦合常数为7，两者几乎一致，说明该烯烃(C-19、C-20)为顺式构型。化合物1的详细结构鉴定数据原始图谱可从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。

图2 化合物1的主要1H-1H COSY、HMBC、NOESY相关

化合物2白色或微黄色固体;分子式C21H24N2O3，ESI-MS：m/z352[M]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.90(1H，s，N-H)，7.57(1H，s，H-17)，7.44(1H，d，J= 7.6 Hz，H-9)，7.20(1H，d，J= 7.6 Hz，H-12)，7.14～7.05(2H，m，H-10，11)，4.53～4.47(1H，m，H-19)，3.75(3H，s，H-23)，3.35(1H，d，J= 11.5 Hz，H-3)，3.11(1 H，dd，J= 12.3，1.9 Hz，H-21)，2.99～2.88(6H，overlap，H-5，6，15，21)，2.58～2.50(2H，overlap，H-5，14)，1.70(1H，m，H-20)，1.54(1H，dd，J= 24.6，12.1 Hz，H-14)，1.41(3H，d，J= 6.2 Hz，H-18)；13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：168.0(C-22)，155.8(C-17)，135.9(C-13)，134.5(C-2)，127.1(C-8)，121.3(C-11)，119.3(C-10)，118.0(C-9)，110.8(C-12)，109.5(C-16)，108.0(C-7)，72.5(C-19)，59.8(C-3)，56.2(C-21)，53.5(C-5)，51.2(C-23)，38.3(C-20)，34.1(C-14)，31.4(C-15)，21.7(C-6)，18.5(C-18)。以上数据与文献报道一致[15]，鉴定其为tetrahydroalstonine。

化合物3透明油状;分子式C21H22N2O2，ESI-MS：m/z335[M+H]+，1H NMR(400 MHz， CDCl3)δ：7.62(1H，d，J= 7.7 Hz，H-9)，7.45(1H，d，J= 6.9 Hz，H-12)，7.39(1H，td，J= 7.7，1.3 Hz，H-11)，7.22(1H，td，J= 7.5，1.0 Hz，H-10)，5.31(1H，q，J= 6.7 Hz，H-17)，2.17(3H，s，H-16)，1.67(3H，d，J= 6.7 Hz，H-23)；13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：183.7(C-3)，169.9(C-22)，156.6(C-13)，137.9(C-8)，136.4(C-18)，128.6(C-11)，125.4(C-10)，123.8(C-9)，120.9(C-12)，115.6(C-17)，77.7(C-7)，64.4(C-3)，58.03(C-20)，56.1(C-21)，54.1(C-19)，49.0(C-5)，37.3(C-6)，27.5(C-15)，26.4(C-14)，21.1(C-23)，12.9(C-16)。以上数据与文献报道一致[16]，鉴定其为vinorine。

化合物4白色固体;分子式C21H24N2O3，ESI-MS：m/z353[M+H]+，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δ：10.46(1H，s，Ar-OH)，8.54(1H，s，N-H)，7.06(1H，d，J= 9.1 Hz，H-12)，6.67(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9)，6.51(1H，dd，J= 9.0，2.1 Hz，H-11)，3.94(2H，d，J= 10.1 Hz，H-17)，1.98(3H，s，H-23)，1.53(3H，d，J= 7.1 Hz，H-18)；13C NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：170.3(C-22)，150.2(C-10)，139.8(C-20)，136.4(C-2)，130.5(C-13)，127.8(C-8)，115.5(C-19)，111.2(C-12)，110.0(C-11)，101.8(C-7)，101.7(C-9)，65.5(C-17)，55.3(C-21)，53.6(C-5)，49.5(C-3)，40.5(C-16)，33.0(C-14)，27.4(C-15)，26.4(C-16)，20.6(C-23)，12.3(C-18)。以上数据与文献报道的一致[17]，鉴定其为17-acetylsarpagine。

化合物5白色固体:分子式C19H20N2O，ESI-MS：m/z292[M]+，1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δ：10.86(1H，s，H-N)，9.57(1H，s，H-17)，7.45(1H，d，J= 8.1 Hz，H-9)，7.34(1H，d，J= 8.1 Hz，H-12)，7.16(1H，J= 7.4 Hz，H-11)，7.10(1H，J= 7.2 Hz，H-10)，5.31(1H，J= 6.8 Hz，H-19)，4.31(1H，d，J= 9.9 Hz，H-3)，3.62(1H，d，J= 17.0 Hz，H-21)，3.50(1H，d，J= 16.7 Hz，H-21)，3.44～3.48(1H，m，H-5)，3.22(1H，d，J= 3.0 Hz，H-5)，2.62(1H，d，J= 15.6 Hz，H-5)，2.57(1H，d，J= 7.6 Hz，H-16)，2.15(1H，t，J= 10.8，1.3 Hz，H-14),2.13(1H，td，J= 11.5，1.5 Hz，H-15)，1.87(1H，d，J= 11.8 Hz，H-14)；13C NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：203.1(C-17)，139.1(C-2)，136.1(C-13)，135.9(C-20)，127.0(C-8)，120.3(C-11)，118.2(C-10)，117.4(C-9)，115.2(C-19)，111.0(C-12)，102.1(C-8)，55.1(C-16)，54.4(C-16)，49.8(C-5)，49.5(C-1)，32.7(C-14)，26.8(C-6)，26.3(C-15)，12.3(C-18)。以上数据与文献报道一致[18]，鉴定其为vellosimine。

3.2 体外肿瘤细胞毒活性筛选

本实验对化合物1～5进行了细胞毒活性的筛选，细胞毒活性检测采用黄酰罗丹明B(SRB)染色法进行测定，测试细胞株为Hela。在100 μmol/L浓度下进行初筛，化合物1、2、4无明显细胞毒性，而3、5具有较强的细胞毒性，抑制率分别为60.3%±2.5%和85.3%±4.5%，喜树碱为阳性对照浓度为5 μmol/L。为进一步验证3、5的细胞毒性，对3、5进行细胞毒活性实验，实验结果表明化合物3、5对Hela细胞具有一定的细胞毒性，化合物3IC50为89.4±1.2 μmol/L，化合物5IC50为15.6±0.7 μmol/L，阳性药物喜树碱IC50为5.21±1.3 μmol/L。

表2 鸡骨常山单体化合物对Hela细胞株毒活性

4 讨论与结论

本次研究从鸡骨常山根的乙酸乙酯萃取B部分分离得到5个单萜吲哚生物碱，其中化合物1为新的吲哚单萜生物碱，化合物3、5磺酰罗丹明B染色法[19]结果显示对宫颈癌细胞存在一定程度的细胞毒性及抗肿瘤活性，化合物3对坐骨神经损伤具有一定治疗作用[20]，本研究一定程度上丰富了该属植物的化学成分及其活性的研究内容。宫颈癌为近年来对女性生命健康危害较大的一种疾病，因此找到有效的治疗药物，研究清楚其机理尤为关键，下一步拟针对各化合物进一步开展相关的生物活性及机理研究。综上所述，本研究确定了鸡骨常山根具有抗肿瘤活性的吲哚生物碱，对其化学成分展开研究具有一定应用价值，将天然产物与疾病治疗联系起来，对天然产物开发与研究具有一定的帮助。