基于网络药理学探讨柚皮苷治疗骨质疏松症的潜在机制

张鹏 余翔 陈卓峰 任辉 沈耿杨 张志达 尚奇 梁德 江晓兵,4*

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 2.广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广东 广州 510405 3.广东医科大学，广东 东莞 523808 4.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种系统性骨病，常引起骨折等严重并发症[1]。OP在中医学里面属于“骨痿”等范畴，其主要病机为肾精不足，骨失滋养[2]。以脊柱变形、全身骨骼疼痛、易出现骨折为主要临床表现[3]。OP与年龄密切相关[4-5]，据统计，2016年我国60岁以上的老年人中超过三分之一患有OP，其中男性约占25 %，女性接近50 %[6]，OP危害老年人的生命健康，增添家庭、社会的负担。抑制骨吸收药物是临床治疗OP的主要药物[7]，但这些药物因使用过程中存在一些并发症从而限制了其临床运用[8]。目前，中医药治疗OP的疗效逐渐被患者所认可，引起了当今国内外学者的关注[9-10]。

作为骨碎补中含量最丰富的一种黄酮类活性分子，柚皮苷(naringin，NR)具备补肾强骨等疗效[11]，在临床上有较好的实际运用和发展前景。目前研究显示NR能促进成骨细胞的增殖[12]，也可通过诱导骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的表达，促进成骨分化[13]。但是，NR治疗OP涉及靶点通路众多，起效机制复杂，传统药理学难以进行系统的分析。随着系统生物学的新兴和发展，网络药理学作为研究潜在分子机制的新方法，更系统综合地分析活性分子对疾病治疗的起效机制，与活性分子多靶点、多途径干预疾病的治疗原理相契合[14]。本文拟运用网络药理学技术探究NR治疗OP的潜在作用机制，为其提供科学的理论依据。

1 材料和方法

1.1 获取NR结构及靶点信息

利用TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)获取NR结构及其靶点信息，同时通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取NR的三维结构(以SDF格式储存)，并将所得到的NR三维结构导入Swiss Target Prediction数据库(http://new.swisstargetprediction.ch/)获得NR的相关靶点，然后将TCMSP数据库、Swiss Target Prediction数据库得到的靶点去重合并得到NR的靶点。利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点转换为对应的人源基因名。

1.2 OP靶点集的获取及NR治疗OP的潜在作用靶点预测

检索GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org)数据库获得OP对应靶点。利用R软件，将OP靶点与 1.1 中靶点进行映射，得到两者交集靶点。

1.3 建立NR治疗OP的靶点蛋白互作网络

在STRING 数据库(https://string-db.org/)中导入交集靶点，隐藏孤立蛋白后得到蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)信息，并将其输入到Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)软件建立PPI网络，同时进行网络拓扑学分析，将网络中高于度值(degree)平均值的靶点蛋白筛选出来作为核心靶点。

1.4 NR治疗OP网络的构建

建立柚皮苷交集靶点与骨质疏松的对应关系，导入 Cytoscape 3.7.2 软件中绘制NR治疗OP网络图。

1.5 GO功能富集分析

使用 R 软件及其程序包对交集靶点进行GO功能富集分析，pvalue Cutoff、qvalue Cutoff均设为0.05，将每类显著性排在前20的富集结果以点状图的形式进行展示。此外，将交集靶点输入至 Cytoscape 3.7.2 软件中进行GO功能富集分析，将主要与疾病相关的生物学过程或功能筛选出来(P< 0.05)，最后将交集靶点及上述生物学过程或功能进行可视化展示。

1.6 KEGG通路富集分析

同样通过 R 软件及其程序包对交集靶点进行 KEGG分析，pvalue Cutoff、qvalue Cutoff均设为0.05，按照显著性进行排序，将富集得到的信号通路(P< 0.05)进行展示，并运用Cytoscape 3.7.2软件绘制NR治疗OP的“通路-靶标”网络图。

2 结果

2.1 NR结构及其靶点信息

通过 TCMSP 数据库和Swiss Target Prediction数据库检索去重后得到105个作用靶点。NR结构相关信息详见表 1，105个作用靶点详见表 2。

表1 柚皮苷的结构Table 1 The structure of naringin

2.2 NR治疗OP的潜在作用靶点预测

共获得OP相关靶点 3 261个，与2.1中得到的105个NR靶点进行映射，得到交集靶点 44个，见图1。NR治疗OP的潜在作用靶点见表3。

图1 柚皮苷-骨质疏松症交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of naringin-osteoporosis intersection targets

表3 柚皮苷治疗骨质疏松潜在作用靶点基因

2.3 PPI网络

将STRING 数据库得到的PPI信息输入到 Cytoscape 3.7.2 软件制作PPI网络图，共涉及41个节点，161条边，详见图2。 该网络中超过度值平均值(7.85)的靶点蛋白有18个，视其为核心靶点，意味着它们很有可能是NR对OP起治疗作用的关键。核心靶点信息详见表4。

图2 潜在作用靶点的PPI网络图Fig.2 PPI network of potential targets

表4 柚皮苷治疗骨质疏松网络核心靶点

2.4 NR治疗OP网络图

构建“柚皮苷-交集靶点-骨质疏松”的对应关系，将其输入 Cytoscape 3.7.2 软件中，得到NR治疗OP网络图。网络由46个节点(其中 1 个NR节点，44个靶点，1 个OP节点)和88条边组成。网络图中蓝色菱形节点代表靶点，红色多边形节点代表“柚皮苷”，橙色椭圆形节点代表“骨质疏松症”，线条代表柚皮苷、骨质疏松症与靶点具有对应关系，见图3。

图3 柚皮苷-交集靶标-骨质疏松网络图Fig.3 Naringin-intersection target-osteoporosis network diagram

2.5 GO功能富集分析

使用R软件进行GO生物过程(GO BP)富集分析，共获得533个结果，主要涉及类固醇激素反应、固有凋亡信号通路、激素分解代谢过程、腺体发育、氧化应激反应、对活性氧的反应、炎症反应的调节等；GO细胞组成(GO CC)富集分析共获得3个结果，涉及膜筏、膜微区、膜区；GO分子功能(GO MF)富集分析共获得71个结果，主要涉及雌激素受体结合、肽链内切酶、跨膜转运蛋白、核受体、转录因子的活性等方面。GO BP、GO CC、GO MF富集分析结果见图4～图6。此外，将 44个靶点导入 Cytoscape 3.7.2 进行GO富集分析，结果主要涉及①炎症相关的，如调节炎症反应等；②细胞周期相关的，如调节细胞增殖、分化、衰老、凋亡；③激素代谢相关的，如雄激素代谢过程，雌激素受体结合等。详见图7。

图4 GO BP富集分析结果Fig.4 GO BP enrichment analysis results

图5 GO CC富集分析结果Fig.5 GO CC enrichment analysis results

图6 GO MF富集分析结果Fig.6 GO MF enrichment analysis results

图7 筛选后的GO富集分析图Fig.7 GO enrichment analysis after screening

2.6 KEGG分析

使用R软件对44个靶点进行KEGG分析。共得到 43个结果，相关信号通路共有11条，详见表5，运用Cytoscape 3.7.2进行网络可视化，详见图8，图中粉红色三角形节点代表信号通路，蓝色椭圆形节点代表基因，线条代表通路与基因之间的对应关系。

3 讨论

3.1 靶标与PPI网络分析

柚皮苷是中药骨碎补中活性成分含量最丰富的一类黄酮类化合物，同时也存在于柑橘类水果和许多中药里面[15]。现有研究表明黄酮类化合物可通过雌激素受体介导、OPG/RANK/RANKL、酶抑制作用、调节信号转导通路等机制预防OP[16]。

表5 KEGG通路富集结果Table 5 KEGG pathway enrichment analysis results

图8 “通路-靶标”网络Fig.8 Pathway-target network

通过靶点预测得到柚皮苷作用于骨质疏松的靶点共44个，经PPI网络筛选后的核心靶标共有18个，主要有 TNF、CASP3、ESR1、CDKN1A等，PPI网络拓扑学特征以炎症反应、细胞周期调节以及激素代谢相关的蛋白居多，与GO富集分析结果相互印证。其中TNF的度值远高于其他核心靶点，推测TNF是柚皮苷治疗骨质疏松的关键靶点。TNF(肿瘤坏死因子)，通称为TNF-α，是一种炎症反应相关的重要因子，可诱导巨细胞集落刺激因子(macro-phagecolony-stimulating factor，M-CSF)的表达，可通过激活NF-kB启动RANKL(NF-κB受体激活因子配体)诱导的破骨细胞生成，加速骨吸收发展进程，为骨质疏松症的上调基因[17-18]。因此，笔者推测柚皮苷可以通过下调骨质疏松症患者体内TNF-α水平，下调RANKL的表达，减少破骨细胞的生成，起到防治OP的目的。CASP3(半胱氨酸蛋白酶3)是度值排列第二的靶标，影响细胞凋亡过程[19]。有研究通过实验证明CASP3 mRNA表达上调对治疗OP有促进作用[20]。进一步的研究表明CASP3的上调可以激活p53信号通路破坏成骨细胞成熟并抑制软骨细胞分化[21]。ESR1(雌激素受体)是度值排列第三的靶标，与骨形成代谢等具有密切关系，ESR1与雌激素结合后，可通过调节细胞因子，影响相关信号通路，调控软骨内成骨的过程，对软骨厚度的维持、骨生长平衡有促进作用[22]。绝经后妇女出现骨质疏松是由于体内缺乏雌激素，致使骨量丢失加速，甚至引发骨折，而ESR1是雌激素在细胞内发挥生理活性的作用靶点，主要表现在细胞的生长分化、衰老凋亡，由此可见ESR1与绝经后骨质疏松密切相关[23]。CDKN1A(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1 A)，又称为p21，能够调控细胞的增值、分化和衰老[24]。成骨细胞数量与细胞增殖密切相关[25]，而细胞增殖周期的进程主要受到G1期调节蛋白的调控[26]。CDKN1A(p21)，作为G1期调节蛋白，能结合细胞周期素与细胞周期蛋白依赖激酶形成的复合体，使其失活[27]，导致细胞周期停滞于G1期[28]。吴银生等[29]研究发现，第3腰椎成骨细胞p21蛋白含量在大鼠去卵巢4、8、12、18、24周显著升高(P<0. 01)。易显富等[30]研究发现p21蛋白表达的下调可促进成骨细胞增殖。刘明等[31]研究发现，新仙灵骨葆胶囊可能通过作用于p21等G1期关键调节蛋白而影响成骨细胞增殖周期，可治疗大鼠去卵巢骨质疏松症。可见，CDKN1A在成骨细胞增殖过程中发挥着关键性的作用。

此外，表3中PTGS1(COX-1)是限制前列腺素生成的一类酶，而前列腺素可以诱导M-CSF以及RANKL的表达，促进破骨细胞分化，抑制成骨细胞功能[18]。ESR2与ESR1同为雌激素的受体，与绝经后骨质疏松相关。

故柚皮苷-交集靶标-骨质疏松网络图关联复杂，可见柚皮苷治疗骨质疏松是通过多靶点多途径之间的相互作用实现的，并且蕴含着多种潜在的治疗作用。

3.2 GO分析和KEGG分析

GO富集分析结果所反映的内容与PPI网络规律相似，与炎症反应、细胞周期调节以及激素代谢相关。而KEGG 通路富集分析结果显示相关靶点基因富集于p53、IL-17、NF-κB、Estrogen、Prolactin等信号通路，可能是柚皮苷治疗骨质疏松症的关键信号通路，KEGG通路富集分析结果反映的内容也与PPI网络拓扑学分析及GO富集分析结果规律相似。相关研究表明，p53信号通路的激活能破坏成骨细胞成熟并抑制软骨细胞分化[21]。IL-17信号通路能够通过IL-17刺激单核细胞分化形成破骨细胞，且IL-17可以促进TNF-α的合成，上调IL-6、NF-κB等细胞因子的表达，促进RANKL诱导的破骨细胞形成[32]。破骨细胞的激活依赖于RANKL与RANK的结合，进而活化NF-kB信号通路，促进破骨细胞的分化[33]，通过下调NF-κB信号通路，能够抑制破骨细胞分化。由此可见IL-17信号通路、NF-κB信号通路与OPG/RANKL/RANK系统调控成骨细胞和破骨细胞的机制密切相关。据此推测IL-17信号通路与NF-κB信号通路可能是柚皮苷治疗骨质疏松症的重要信号通路。Estrogen(雌激素)信号通路可以汇聚Wnt信号通路、蛋白激酶通路、BMP-2信号通路等共同调控成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化和凋亡[34]。此外Prolactin(泌乳素)信号通路同Estrogen(雌激素)信号通路均表明柚皮苷具有雌激素调节作用，是柚皮苷可运用于绝经后OP的证据。

综上所述，我们的研究结果提示柚皮苷可能通过多靶点、多通路调节炎症反应、细胞周期、激素代谢来治疗骨质疏松。本研究所得结果与现有的骨质疏松研究结果相吻合，为后续的柚皮苷药理机制分析和实验设计提供了数据支持。