PCPA致失眠大鼠的时钟基因表达变化

杨 阳 杨晓敏 胡秀华 曹 简郭血骄 杨向竹 郭 健 赵俊云

失眠是众多睡眠障碍中最为常见的一种，主要表现为入睡难、清醒早、睡眠质量低和睡眠时间短等特点。长时间的失眠状态将导致严重的后果，如记忆力或注意力的下降、各种慢性疾病或精神疾病，包括阿尔茨海默病、衰老等[1]。对氯苯丙氨酸(para-Chlorophenylalanine, PCPA)是经典失眠动物模型的诱导因素。PCPA可以通过抑制色氨酸羟化酶以阻碍5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)的合成进而导致失眠，目前对PCPA致失眠的机制研究也多集中在5-HT方面。失眠与多种因素有关，其中控制昼夜节律的生物钟系统起着主导作用。生物钟系统包括位于下丘脑的主钟以及外周各器官的外周时钟，其中主钟于视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)产生节律信号并通过神经和体液的方式送往全身。机体的自主性节律主要是由时钟基因Clock、Bmal1、Per和Cry基因通过负反馈调节所形成的。肝脏是涉及糖代谢和脂代谢，并与时钟基因联系紧密的重要子钟器官之一，其功能的发挥受到主钟和外周时钟的精密调控。本研究采用经典失眠动物模型(PCPA致失眠大鼠)，探究PCPA致失眠大鼠中脑部和肝脏时钟基因的表达变化，进一步探讨失眠与时钟基因表达变化的关系。

材料与方法

1.材料：16只SPF级雄性SD大鼠，年龄6～8周，体质量200±20g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物许可证号为SCXK(京)2015-0015。其他主要材料：PCPA(美国Ark PharmLnc.公司，批号：AK-80383，纯度>98%)，Trizol(美国Invitrogen公司)，M-MLV反转录酶、dNTP(10mmol/L)、2(Ex TaqMix[宝生物工程(大连)有限公司]，DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、6×Loading Buffer[美国Fermentas(MBI)公司]，引物(北京中美泰和生物技术有限公司)，ELISA检测试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)。实验仪器：大鼠旷场实验箱，Safire2酶标仪(瑞士Tecan公司)，3K15高速冷冻离心机(美国Eppendorf公司)，S-18KS手持电动微量组织匀浆机(莱普特公司)，2720型PCR仪(美国ABI公司)，Roche LightCycler®480II 实时荧光定量PCR系统(德国Roche公司)。

2.方法：(1)模型动物的喂养：适应性喂养16只SD雄性大鼠，1周后将其随机分为对照组(8只)和模型组(8只)，模型组一次性腹腔注射PCPA300mg/kg，对照组腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液，饲养过程中采取正常环境光照，给予大鼠正常饮食。(2)旷场实验：实验第3天进行旷场实验。旷场实验箱体积为100cm×100cm×45cm，将大鼠轻轻放在旷场正中格，系统自动记录大鼠3min内行为的垂直得分(穿过地面方块的数量)与水平得分(前爪腾空或攀附动作的次数)，以大鼠活动的总路程(垂直得分与水平得分之和)作为本实验的检测指标。在每次实验结束后，将动物粪便清除并擦拭实验箱底部及内壁，75%乙醇擦拭消毒，乙醇挥发无味后进行下一次操作。实验期间保持安静，周围参照物不变，实验者不变。(3)ELISA法检测HPA轴激素水平：实验第3天，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。腹主动脉采血，4℃下静置1h；3500r/min离心15min，收集血清，按照ELISA试剂盒说明书进行检测。(4)RT-qPCR检测时钟基因转录水平：采血后，从大脑皮层和肝右叶靠近门静脉处取样，匀浆处理。从对照组和模型组中各取3只大鼠的脑、肝脏匀浆样品，每个样品进行1次RT-qPCR试验。采用Trizol法提取脑部、肝脏mRNA，RNA琼脂糖凝胶电泳观察其浓度和纯度。将RNA提取物反转录为cDNA。RT-qPCR反应条件为95℃ 5min预变性后，95℃ 15s，62℃ 30s(荧光检测)，45个循环。引物序列详见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

结 果

1.自主活动：与对照组比较，模型组大鼠行为学得分(大鼠3min内活动的总路程，即穿过地面方块的格数与前爪腾空或攀附动作的次数之和)显著升高(P<0.01)，详见表2。

表2 PCPA对失眠大鼠旷场行为学得分和HPA轴血清水平的影响

2.HPA轴激素水平变化：两组比较差异无统计学意义，详见表2。

3.脑部时钟基因转录水平：与对照组比较，模型组脑部Clock、Bmal1、Cry1的表达显著下降(P<0.05)；Cry2的表达显著上升(P<0.05)，Per1、Per2的表达变化不显著，详见表3。

表3 PCPA对失眠大鼠脑部时钟基因表达情况的影响

4.大鼠肝脏时钟基因转录水平：与对照组比较，模型组肝脏Clock、Cry2、Bmal1、Per2、Cry1的表达变化不显著，Per1的表达显著上升(P<0.01)，详见表4。对比脑部与肝脏时钟基因转录水平的变化趋势，发现脑部与肝脏的Bmal1、Per1、Cry1、Cry2的变化趋势一致(Per1、Cry2上升，Bmal1、Cry1下降)；而Clock、Per2的变化趋势相反，脑部Clock基因表达下降，Per2基因表达上升；肝脏Clock基因表达上升，Per2基因表达下降。

表4 PCPA对失眠大鼠肝脏时钟基因表达情况的影响

讨 论

PCPA在啮齿类动物致失眠中的作用显著，操作简便，被广泛应用于失眠研究中。中枢5-HT水平与睡眠有密切的联系，若脑内5-HT水平降低，则动物会出现失眠症状。5-HT以体内的色氨酸为原料进行生物合成。色氨酸羟化酶是5-HT生物合成中的限速酶，而PCPA是色氨酸羟化酶的选择性抑制剂，PCPA可通过抑制色氨酸羟基化以降低5-HT的合成。研究表明，大鼠腹腔注射PCPA后，大鼠脑中的5-HT水平会逐渐下降，在第3天达到峰值，同时大鼠会表现出昼夜节律消失、攻击性增加、活动增加等症状[2]。旷场实验能够评价动物活动的主动性，本实验发现模型组行为学得分显著高于对照组，符合PCPA模型症状[3]。

下丘脑中有多种5-HT能纤维，参与HPA轴的调节。目前认为HPA轴的过度激活是失眠的生理学基础之一，失眠中的生理兴奋一部分通过HPA轴的过度激活体现。生理条件下HPA轴通过负反馈调节，对维持正常的睡眠-清醒节律有一定意义[4]。另外，昼夜节律与HPA轴之间相互作用，糖皮质激素可通过与糖皮质激素反应元件结合改变生物钟基因，参与外周时钟与主钟的节律同步调节[5]。睡眠时间还和炎性因子、HPA轴的激活和外周皮质醇的释放有一定的关系[6]。有研究发现,失眠者的ACTH和皮质醇水平有一定升高[7]。本实验中HPA轴的变化差异无统计学意义，基本符合临床中失眠患者的HPA轴激素变化趋势[8]。结合旷场实验中大鼠兴奋性的显著提升与大鼠HPA轴活跃度的上升，说明PCPA诱导失眠是有效的。

在哺乳动物中，时钟基因几乎存在于所有组织和细胞中。在SCN区的主钟主要受到来自视网膜神经细胞的光-电信号调节，而外周时钟则既受到来自主钟的调节，同时也受到其他诸多外界因素的调控，如温度、进食模式、营养条件等。在动物试验中，当SCN被破坏时昼夜节律完全消失。SCN区含有约20000个能够自主调节节律的细胞，通过神经调节和体液调节等方式将节律信号传递到全身各处[9]。SCN区细胞的自主节律由时钟基因调控，时钟基因是机体自身调节的重要基础部分之一，与生命的各种活动密切相关[10]。在生理条件下，时钟基因在一天中的表达波动通过负反馈调节。Clock和Bmal1基因的优势表达导致清醒，Per和Cry基因的优势表达导致睡眠。在11:00～14:00时，Clock和Bmal1基因表达量逐渐升高并产生峰值，从而产生了清醒[11]。Clock和Bmal1基因表达量的升高激活了Per和Cry基因的表达，Per和Cry基因产物能进入细胞核并抑制Clock和Bmal1基因的转录，导致了睡眠[12]。Per和Cry产物会被自行降解，降解后则又迎来下一轮清醒-睡眠周期。如此交替，形成了昼夜节律性变化[13]。

本实验中脑部主钟的时钟基因呈现了有规律性的变化，正向调控因子Clock基因和Bmal1基因表达下调，负向调控因子Per和Cry基因表达上调。相较于其他造模方式无规律的时钟基因变化，PCPA造模法体现出了独特的意义。然而造成这种规律的机制还不明确，有待于进一步研究。但是在本实验大鼠脑部各时钟基因的规律性变化中，Cry1基因的表达出现了反常。Cry1的反常表达可能与细胞自噬有一定联系。化合物2-PCPA具有促进细胞自噬功能，而PCPA与2-PCPA在结构上相似，提示PCPA可能具有类似2-PCPA的促进细胞自噬作用[14]。

每个器官协调主钟与外周时钟的机制都有所不同，有时甚至能够拒绝来自主钟的调控。肝脏是涉及糖代谢和脂代谢的重要器官，其功能的发挥受到主钟和外周时钟的精密调控，故本实验选择肝脏作为子钟器官的代表进行研究。本研究中，肝脏外周时钟基因变化的规律性较脑部主钟的变化规律性低，正向调控因子与负向调控因子均各有升降。除肝脏的Clock、Per2的表达趋势与脑部不同之外，其他时钟基因的表达均与脑部时钟基因的变化趋势一致。肝脏除了受到时钟基因的调控之外，胰岛素、生长素、肠源性激素、催产素等，都会对肝脏的时钟基因产生影响[15]。肝脏的时钟基因表达还与循环胰岛素水平有关，当给予大鼠高脂饮食时，大鼠的Clock和Bmal1基因表达会出现紊乱。

综上所述，本研究发现，PCPA致失眠大鼠的脑部Clock、Bmal1、Cry1基因表达下降，Per1、Per2、Cry2基因表达提高；肝脏Clock、Per1、Cry2的表达上升，Bmal1、Per2、Cry1基因表达下降。本研究中还存在有待于进一步研究的问题，如取材时间、蛋白水平等，后续工作将进一步阐明失眠动物模型的相关机制，为失眠研究提供多层次的实验依据。