不同酵母对赤霞珠桃红葡萄酒香气的影响

郭静娴，谢 涵，华玉波，石 英，吴广枫，段长青，兰义宾*

（1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院 葡萄与葡萄酒研究中心，北京 100083；2.农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083；3.山东台依湖葡萄酒业股份有限公司，山东 威海 264500）

21世纪以来，中国葡萄与葡萄酒产业发展迅速，葡萄栽培面积迅速扩大，葡萄总产量快速提升。我国的酿酒葡萄品种以红葡萄品种为主，约占80%；白葡萄品种约占20%。赤霞珠（Vitis viniferacv.Cabernet Sauvignon）是第一主栽品种，其次是蛇龙珠（V.viniferacv.Gernischt）、美乐（V.viniferacv.Merlot）、霞多丽（V.viniferacv.Chardonnay）等[1]。目前，我国以优质干红葡萄酒的生产为主，且常应用抽汁工艺来提升其感官品质，抽汁的部分主要用于新红葡萄酒的酿造，生产出的桃红葡萄酒具有浓郁的果香和花香，口感上有从干型到半甜型的不同风格，受到中国广大消费者的欢迎。

香气是评价葡萄酒的重要感官品质指标之一，香气成分在葡萄酒中的种类、含量、性质及相互之间的平衡，决定了葡萄酒的风格和典型性[2]。研究表明，贡献桃红葡萄酒果香的香气物质主要为高级醇类（如苯乙醇）、β-大马士酮和一些酯类（如己酸乙酯和乙酸异戊酯）等，这些香气物质多数与酵母发酵有关[3]。李景明等[4-5]分别分析了不同酵母发酵的赤霞珠干红葡萄酒和贵人香（V.viniferacv.Italian Riesling）干白葡萄酒的香气成分，研究结果均表明不同酵母发酵葡萄酒中的香气物质种类差别微小，而醇类、酸类和酯类含量差别明显，不同酵母产醇产酸产酯能力存在差异；李凯等[6]应用顶空固相微萃取（head space solid phase microextraction，HS-SPME）-气相色谱质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术结合香气活力值（odoractivity value，OAV）对比了不同商业酿酒酵母酿造的玫瑰香（V.viniferacv.Muscat Hamburg）葡萄酒，发现不同商业酿酒酵母条件下玫瑰香葡萄酒的香气轮廓存在差异，E491酵母发酵的玫瑰香葡萄酒香气典型性强。

目前，有关不同酵母对桃红葡萄酒香气影响的研究较少，随着桃红葡萄酒占据越来越大的葡萄酒市场[7]，研究选择合适的酵母菌来获取具有典型风格的桃红葡萄酒，是非常有必要的。本研究以赤霞珠葡萄为原料，利用顶空固相微萃取和气质联用技术分析比较了4种不同商业酵母（CY3079、Zymaflore X16、TXL和STR）发酵的赤霞珠桃红葡萄酒在酒精发酵结束以及瓶储陈酿一年后香气物质之间的差异，研究不同酵母和瓶储陈酿对新鲜桃红葡萄酒中主要呈香物质的影响，以期为生产者在新鲜桃红葡萄酒酿造过程中选择合适的酵母提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：葡萄酒样均采集于山东台依湖葡萄酒业有限公司，利用4种不同类型的商业酵母酿造，分别为两款产酯能力强的酵母，包括法国Laffort公司的Zymaflore X16酵母和法国Lamothe-abiet公司的STR酵母；一款在酒精发酵结束后能够迅速自溶的酵母，为法国Lallemand公司的CY3079酵母，以及一款产硫醇能力强且产挥发性酚能力弱的酵母，为法国Lamothe-abiet公司的TXL酵母。葡萄酒灌装后存放在恒温、恒湿的酒窖中（温度15 ℃，相对湿度75%）。取样点为酒精发酵（alcoholic fermentation，AF）结束和瓶储陈酿一年（1Y），共8个样品，分别表示为CY3079-AF、X16-AF、TXL-AF、STR-AF、CY3079-1Y、X16-1Y、TXL-1Y和STR-1Y。取样后的样品存放于-20 ℃冰箱，用于后续分析。

氯化钠（分析纯）：北京化学试剂公司；C6-C24正构烷烃和所有挥发性物质标准品（纯度＞99%）：美国Sigma公司，瑞士Fluka公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890 GC气相色谱仪、Agilent 5975C MS质谱仪：美国安捷伦科技有限公司；HP-INNOWAX毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25μm）：美国J&WScientific公司；CTCCombiPAL autosampler多功能自动进样器：瑞士Zwingen公司；2 cm固相微萃取头（DVB/CAR/PDMS）：美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS条件

利用本实验室已优化的顶空固相微萃取方法对葡萄酒香气物质进行萃取[8-9]，具体步骤如下：取5 mL样品、1 g NaCl和10 μL内标（4-甲基-2-戊醇，1.008 6 g/L）置于20 mL样品瓶中，迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子密封。将样品瓶置于多功能自动进样器的托盘上，系统按照以下条件自动完成样品萃取及进样：将样品置于40 ℃的加热槽中保持30 min，然后将已活化的固相微萃取头插入样品瓶的顶空部分，萃取30 min，加热槽转速为500 r/min。然后将萃取头插入气相色谱进样口，采用不分流模式，250 ℃热解吸8 min。

利用本实验室已经优化的气质联用的方法[8]，分析检测样品中的香气物质。载气为高纯氦气（He），流速为1 mL/min。柱温箱的升温程序为：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持5 min。质谱接口温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，离子源为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV。采用全离子扫描模式，质量扫描范围为29～350 u。每个样品重复进样3次。

1.3.2 定性定量方法

香气物质的定性分析[8]：采用自动质谱退卷积定性系统（auto mass spectral deconvolution &identification system，AMDIS）解谱，利用峰质谱图、保留时间或保留指数，与标准品、美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011标准谱库以及文献收录化合物的质谱信息进行匹配，进行化合物的定性分析。

香气物质的定量分析[8]：在模拟酒溶液（酒精度12%vol，酒石酸7g/L，pH=3.3）中，配制15个浓度梯度的香气物质标准溶液，制作标准曲线进行定量。

1.3.3 数据统计分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）和单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）采用XLSTAT软件实现。8个葡萄酒样品之间香气物质含量的ANOVA分析采用Duncan 检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同酵母发酵的桃红葡萄酒中香气物质的差异

本研究共鉴定到40种香气物质，包括9种高级醇类、8种直链脂肪酸乙酯类、7种高级醇乙酸酯类、8种其他酯类、4种萜烯及C13-降异戊二烯类、3种中短链脂肪酸类和1种醛类物质（见表1）。由表1可知，4种不同酵母发酵的桃红葡萄酒在酒精发酵结束和经一年瓶储陈酿后的香气物质种类基本相似，但其含量有所差异。除正壬醇仅在瓶储一年的样品被检出，乙酸癸酯仅在酒精发酵后的样品中检测出外，其他香气物质均在8个酒样中都被检测到。通过OAV分析发现，共有17个香气物质的浓度超过其感官阈值，其中己酸乙酯的OAV值达759，然后依次为乙酸异戊酯（OAV=561）、β-大马士酮（OAV=413）、丁酸乙酯（OAV=118）、癸酸乙酯（OAV=104）、辛酸异戊酯（OAV=84）、辛酸（OAV=47）和乙酸乙酯（OAV=18），这些物质是赤霞珠桃红葡萄酒的主要呈香物质。

表1 不同酵母发酵的赤霞珠桃红葡萄酒在酒精发酵结束和瓶储一年阶段的香气物质浓度Table 1 Concentrations of volatile compounds in Cabernet Sauvignon rose wines fermented by different yeast strains after alcoholic fermentation and one-year bottle aging

萜烯和C13-降异戊二烯类：C13-降异戊二烯和萜烯类物质主要来源于葡萄果实，是在葡萄浆果发育期间合成的次级代谢产物，具有较低的感官阈值，常贡献葡萄酒优雅的花香和果香[2]。萜烯和C13-降异戊二烯类物质的总量在Zymaflore X16酵母发酵结束后的酒样（X16-AF）达到最高，TXL酵母发酵的瓶储一年酒样（TXL-1Y）次之。其中超过阈值的仅有β-大马士酮，该物质具有蜂蜜、煮苹果味和花香等香气，因其具有极低的感官阈值，仅为0.05 μg/L（水醇溶液）[10]，对葡萄酒香气有重要的贡献。8款葡萄酒中该物质的OAV值均超过179，在Zymaflore X16酵母发酵结束的酒样和TXL酵母发酵的瓶储一年的酒样达到最高，分别为413和355。

高级醇乙酸酯类：高级醇乙酸酯是酒精发酵过程中酵母的醇乙酰转移酶（alcohol acetyltransferases，ATF）催化乙酰辅酶A与糖或氨基酸降解代谢产生的高级醇反应形成的[16]。在酒精发酵后酒样中高级醇乙酸酯类物质的总含量均远高于瓶储一年后的酒样，Zymaflore X16酵母酒精发酵后酒样（X16-AF）该类物质含量最高，其次为STR酵母酒精发酵后酒样（STR-AF）。通过计算物质的OAV值发现，高级醇乙酸酯中乙酸异戊酯的OAV值达到最大（OAV＞100），乙酸异戊酯在酒精发酵后的酒样中含量较高，瓶储一年后其含量大幅度降低。Zymaflore X16酵母酒精发酵后酒样（X16-AF）中乙酸异戊酯含量显著高于其他三个酵母发酵的酒样；瓶储一年后，STR酵母发酵的酒样中乙酸异戊酯含量则要高于其他三种酵母发酵的酒样。

直链脂肪酸乙酯和其他酯类：脂肪酸乙酯类是酒精发酵过程中乙醇与酵母脂肪酸代谢过程中产生的脂酰辅酶A反应产生的，受酵母中乙酯合成酶（ethyl ester biosynthesis gene 1，EEB1）和乙醇乙酰转移酶（ethanol hexanoyl transferase 1，EHT1）的调控，同时也与原料中脂肪酸的含量有关[17]。脂肪酸乙酯中对葡萄酒的香气有直接贡献的有丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯和辛酸乙酯，而其他酯类中对香气有直接贡献的仅为辛酸异戊酯，其中己酸乙酯的OAV值最大（＞300），这些酯类均在CY3079和Zymaflore X16酵母发酵的酒精发酵后酒样中含量较高，表明这些葡萄酒可能比其他葡萄酒样品显示出更浓郁的果香和花香。而瓶储一年后，脂肪酸乙酯类物质在STR酵母发酵的酒样中含量较高，但整体上这些化合物含量低于酒精发酵后酒样，可能是由于酯类物质在瓶储过程中水解而减少造成的[18]。

高级醇类：高级醇是酵母通过艾丽希途径（Ehrlich pathway）降解氨基酸产生的，对葡萄酒香气的贡献主要取决于它们在葡萄酒中的浓度[19]。一般认为，当其质量浓度低于300 mg/L时可以产生愉悦的香气，而葡萄酒中含有高于400 mg/L的高级醇时则表现为不良气味[17]。本研究中，除了TXL酵母发酵的酒样，其他酵母发酵的葡萄酒中的总高级醇含量均低于300 mg/L。不同酵母酒精发酵后高级醇含量的差异经瓶储一年仍保持一致。物质浓度超过感官阈值的高级醇包括异丁醇、异戊醇和苯乙醇。在TXL酵母酒精发酵结束和瓶储一年的酒样中异丁醇含量均达到最高，但异戊醇则在Zymaflore X16酵母酒精发酵后的酒样（X16-AF）中含量最高。苯乙醇具有玫瑰和蜂蜜的香气，常被认为对葡萄酒的花香有较大贡献，该物质在CY3079、X16和TXL三款酵母酒精发酵后的酒样中含量均较高。

中短链脂肪酸类：不同酵母发酵的桃红葡萄酒中共在检测到3种脂肪酸，其中仅辛酸的浓度超过阈值。酒精发酵结束的酒样中，CY3079-AF样品中短链脂肪酸的含量最高，达27.07 mg/L，一定量的挥发性脂肪酸能够提高葡萄酒香气的复杂性[20]。经过1年的瓶储陈酿，该类物质的含量大幅下降，其中在X16-1Y和STR-1Y酒样中含量最低，仅为3～4 mg/L。

2.2 香气物质轮廓图对比

评价各香气物质对酒香气的贡献用OAV值作为参考指标。研究中分别以酒精发酵后和瓶储一年的样品中OAV＞1的17种挥发性香气化合物的香气描述类别为维度，以OAV值总和的大小展示每种香味强弱做出香气物质轮廓图，结果见图1。

图1 不同酵母酿造的赤霞珠桃红葡萄酒在酒精发酵结束（a）和瓶储陈酿一年后（b）的香气轮廓图Fig.1 Aroma profile of a Cabernet Sauvignon rose wine fermented by different yeast strains after alcoholic fermentation (a) and one-year bottle storage and aging (b)

由图1（a）可知，在酒精发酵结束阶段，赤霞珠桃红葡萄酒的果香、甜香和花香比较突出，而植物味较弱。通过比较4种酵母的香气轮廓发现，利用酵母Zymaflore X16发酵的桃红葡萄酒中果香、甜香最高，依次为CY3079、TXL和STR，这与乙酸异戊酯、辛酸异戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的含量较高有关；而CY3079酵母发酵的葡萄酒中脂肪味较突出，这与CY3079产生较多的中短链挥发性脂肪酸有关（如辛酸等），这与CY3079酵母容易自溶有关。此外，CY3079-A和TXL-AF酒样中的植物味显著高于X16-AF和STR-AF。

由图1（b）可知，瓶储陈酿一年后桃红葡萄酒中最浓郁的香气类型依然是果香，其次是甜香和花香，这与酒精发酵结束酒样的结果一致。但是，经过一年的瓶内陈酿，果香浓郁度显著低于酒精发酵结束阶段，这是因陈酿阶段脂肪酸乙酯、高级醇乙酸酯等酯类物质的下降引起的。通过比较4种酵母发酵酒样的香气轮廓发现，瓶内陈酿一年后不同处理葡萄酒之间的果香、甜香和花香浓郁度差异变小，而脂肪味和植物味的差异变大。TXL-1Y酒样中脂肪味最为浓郁，其次为酒样CY3079-1Y、STR-1Y和X16-1Y。

2.3 主成分分析

为了进一步分析不同的酵母发酵的桃红葡萄酒在酒精发酵结束和瓶储一年阶段香气物质的差异，选择OAV值＞0.1的19个挥发性香气物质作为自变量进行主成分分析，结果见图2。

由图2（a）的PCA得分图可以看出，主成分1（PC1）可以解释52.62%的初始变量，能够将4种酵母酒精发酵结束和瓶储一年的样品分开，酒精发酵后的样品位于PC1正半轴，瓶储一年后的样品位于PC1负半轴。由图2（b）载荷图可以看出，与PC1呈正相关的物质为直链脂肪酸乙酯（如丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等）、高级醇乙酸酯（如乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯等）和中短链脂肪酸（如丁酸、辛酸和癸酸等），说明了上述这些在酒精发酵阶段酵母代谢产生的香气物质在瓶内陈酿过程中快速下降，导致了桃红葡萄酒的果香、甜香和脂肪味的浓郁度呈下降趋势。主成分2（PC2）可以解释17.61%的初始变量，能够将CY3079发酵的酒样与其他酵母分开，位于PC2的负半轴。由图2（b）可知，与PC2呈正相关的物质主要包括异戊醇、乙酸乙酯、异丁醇、苯乙醇和β-大马士酮，而与PC2呈负相关的物质主要有3-甲硫基丙醇和正己醇。说明与其他酵母相比，CY3079酵母发酵酒样的特征物质是高含量的3-甲硫基丙醇和正己醇。另外，STR和TXL两款酵母酒精发酵结束阶段香气物质轮廓极其相似，而Zymaflore X16、STR和TXL三款酵母发酵葡萄酒陈酿一年后香气物质轮廓较为类似。综合PC1和PC2来看，Zymaflore X16和CY3079酵母在酒精发酵阶段的产酯能力强于STR和TXL酵母，但是这种差异随着瓶内陈酿逐渐缩小。

图2 不同酵母发酵的赤霞珠桃红葡萄酒香气物质的主成分分析得分图（a）和载荷图（b）Fig.2 Score plot (a) and loading plot (b) of principal component analysis of aroma compounds in Cabernet Sauvignon rose wines fermented by different yeast strains

3 结论

采用顶空固相微萃取和气相色谱与质谱联用技术分析比较了不同酵母发酵的赤霞珠桃红葡萄酒的香气物质差异。结果表明，CY3079、Zymaflore X16、TXL和STR四种酵母发酵的赤霞珠桃红葡萄酒中主要香气的组成种类基本相似，但不同香气物质含量存在差异。总体上，赤霞珠桃红葡萄酒的主要呈香物质为己酸乙酯、乙酸异戊酯、β-大马士酮、丁酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、辛酸和乙酸乙酯等香气物质。酒精发酵结束阶段，Zymaflore X16和CY3079酵母产生脂肪酸乙酯等酯类物质的能力较强，赋予其更加浓郁的果香、甜香和花香；经过一年瓶储后，4款酵母发酵的桃红葡萄酒中酯类物质快速水解，减小了酯类物质含量的差异，最终缩小了葡萄酒果香、甜香和花香的差异。本研究的结果表明，商业酵母的选择对桃红葡萄酒的香气品质的影响十分重要，合理应用不同类型的酵母是酿造不同香气风格类型的桃红葡萄酒的重要手段。