DLTH通过调节免疫功能和软骨降解从而抑制RA的作用

王琪珊，范凯健,2，许冰馨，滕 辉，陈斯佳，王婷玉

(1.上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海 200011；2.上海市崇明区精神卫生中心药剂科，上海 202150)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫系统疾病,免疫系统的紊乱被认为是导致RA发病的主要原因。脾脏作为人体内最为重要的免疫器官，同时也是人体内淋巴细胞聚集的场所。T淋巴细胞主要分为辅助性T淋巴细胞(T helper cells，Th)和抑制性T淋巴细胞(suppressor T cells，Ts)，其平衡的失调会导致免疫性疾病的产生。T淋巴细胞的调节作用主要通过其分泌的细胞因子来实现，而有些细胞因子具有很强的促炎功能并能加剧RA的病程进展。RA的主要特征也包括关节炎症和软骨破坏。关节的慢性炎症状态会导致成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)的激活和广泛介质的释放，而这些介质又作用于免疫细胞和软骨细胞，从而加剧炎症反应和软骨损伤[1]。

糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)在RA的治疗中起着不可替代的作用，因为它们可以快速缓解关节肿胀和关节损伤[2]。但是，由于GCs的多靶点作用，在全身给药后已报道了多种不良反应，例如体质量减轻和高血糖。因此，迫切需要提高GCs治疗的安全性。为了更加安全有效地使用GCs，研究人员开始开发针对GCs修饰的药物。药物传递系统(drug delivery systems，DDS)可以在预定的时间或所需的特定位置以预定的速率传递药物来实现更好的治疗效果并克服常规药物制剂的不足。作为先进的DDS，可注射的温敏水凝胶起着非常重要的作用[3]。以体内注射的方式，水凝胶在正常人体温度下变为半固体的凝胶。将地塞米松掺入水凝胶后，该系统将能充当体内持续的地塞米松释放库[4]。可注射的温敏凝胶系统拥有多种优点，例如疏水性药物的溶解度提高、安全性提高、位点特异性递送。因此，在可注射的温敏凝胶的辅助下，原位给药是局部给药的有效途径。本研究将通过观察胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠关节腔内注射地塞米松温敏凝胶(dexamethasone-loaded thermosensitive hydrogel，DLTH)后免疫功能和软骨降解的变化，以确定DLTH治疗RA的潜能。

1 材料与方法

1.1 实验动物6-8周龄SPF级雄性Wistar大鼠(体质量：200-250 g)30只，由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物房所提供[SYXK(沪)2016-0016]。常规饲养于拥有独立通气笼盒(individual ventilated cages，IVC)的动物房，12 h光照和夜循环，温度(22±2)℃，湿度50%-60%。

1.2 主要试剂与仪器牛Ⅱ型胶原(Chondrex公司，批号170376)、弗氏不完全佐剂(Chondrex公司,170594)、地塞米松(Stemcell Technologies,批号BX27114)、TRIzol(美国Ambion公司，批号184608)。PCR引物(上海生工生物科技有限公司)、PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)、动物脾脏组织淋巴细胞分离液(天津灏洋华科生物科技有限公司)。7500实时定量PCR仪为美国Thermo Scientific公司产品,酶标仪为美国Bio Tek公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1地塞米松温敏凝胶的制备 将壳聚糖溶解在1%的醋酸溶液中制备成2%的溶液。加入一定量的甘油和地塞米松药物溶液，并在搅拌中滴入硼砂溶液，最后在pH=7的条件下获得地塞米松浓度为2.5 g·L-1的新型DLTH。凝胶在室温为流动液体，在37 ℃时为半固态水凝胶状态(Fig 1)。

Fig 1 Morphology of hydrogel at different conditionsA.At room temperature;B.At 37 ℃

1.3.2CIA模型的建立与给药 d 0的时候，将牛Ⅱ型胶原与弗氏不完全佐剂按1 ∶1混匀成乳剂后环绕大鼠尾根部进行注射。d 7时，以同样方式注射于大鼠尾根部。将造模成功的大鼠随机分为模型组和DLTH组，同时设置对照组。从d 12起，DLTH组大鼠双侧膝关节内各注射40 μL DLTH(即1 mg·kg-1地塞米松)，每周2次，连续3周。对照组和模型组注射等量生理盐水。

1.3.3ELISA检测细胞因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达 在实验结束时，腹腔内注射戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)麻醉所有大鼠。从麻醉大鼠眼睛的内眦静脉收集血液。将血液在4 ℃下以3 600 r·min-1离心10 min后获得血清。根据说明书，使用ELISA试剂盒测量血清中的细胞因子(TNF-α、IL-1β)水平。

1.3.4脾脏淋巴细胞的提取和病理学观察 给药结束后，眼周取血后处死大鼠，取出脾脏，将脾脏组织一半固定于4%的多聚甲醛中，一半取大鼠的脾淋巴细胞。将3组大鼠的脾脏，研磨、过滤、离心后加红细胞裂解液，去除红细胞后，可获得脾脏组织单细胞悬液。根据说明书，取等量的脾脏组织单细胞悬液加于淋巴细胞分离液液面上，500×g离心30 min。离心后，用吸管吸取环状乳白色淋巴细胞层，并加清洗液再次离心清洗细胞，得到脾脏淋巴细胞。将大鼠的脾脏组织进行石蜡包埋和病理切片，经苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)后，用显微镜观察病理改变。根据生发中心，动脉周围淋巴鞘(periarterial lymphatic sheath，PALS) 的细胞密度、边缘区来进行评分:0分为正常;1分为轻度;2分为中度;3分为重度;4分为极重。

1.3.5膝关节的组织病理学分析 分离后肢，将其置于4%多聚甲醛中24 h，然后用0.5 mol·L-1EDTA脱钙并包埋在石蜡中。制备5 μm厚的石蜡切片，然后用二甲苯脱蜡，用乙醇梯度脱水，最后进行甲苯胺蓝染色，通过甲苯胺蓝染色分析膝关节中的软骨降解情况。

1.3.6膝关节的免疫组化分析 将切片在二甲苯中脱蜡，并用梯度乙醇水化。添加蛋白酶K消化缓冲液以修复抗原，并添加3%过氧化氢以阻断内源性过氧化物酶。用5%的BSA封闭，然后将它们与一抗(基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、MMP-13，聚集蛋白聚糖酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5，ADAMTS-5)在4 ℃孵育过夜。洗涤一抗，并与二抗在室温下孵育30 min，然后添加DBA进行显色。用Mayer苏木精复染后封片。由两名独立的观察员评估关节软骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5的表达水平。

1.3.7PCR检测相关细胞因子的表达情况 分离对照组、模型组和给药组大鼠脾淋巴细胞和软骨组织进行PCR检测。使用TRIzol试剂提取总RNA，并测量其浓度和纯度。根据标准程序使用cDNA反转录试剂盒逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR引物由上海生工生物有限公司合成。引物见Tab 1。

2 结果

2.1 DLTH对CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量的影响与对照组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α的表达量明显升高。在给予DLTH治疗后，这些炎症因子的表达都明显降低，见Fig 2。

Fig 2 Effects of IL-1β and TNF-α **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

2.2 DLTH对CIA模型脾脏病理的影响与对照组相比，CIA大鼠脾脏结构出现严重的变形，白髓增殖明显，纤维囊变薄，并且有大量生发中心形成。在给予DLTH治疗后，脾脏结构病理性变化明显改善，见Fig 3。

2.3 DLTH对CIA大鼠脾淋巴细胞中炎症因子的影响相较对照组，模型组脾淋巴细胞中，TNF-α mRNA的表达量明显升高。在给予DLTH治疗后，其表达量明显降低。与对照组相比，模型组中Th1细胞相关的IL-2、干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)，Th2细胞相关的IL-4、IL-5，及Th17 细胞相关的IL-17a的基因表达量明显增加，而Treg相关的细胞因子IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)基因表达量显著降低。DLTH膝关节给药后，以上炎症状态可明显被逆转，见Fig 4。

2.4 DLTH对CIA大鼠脾淋巴细胞中特异性转录因子的影响T-bet，RORγT、GATA3和Foxp3是Th1、Th17、Th2和Treg的特异性转录因子。T-bet、RORγT的基因分别是Tbx21、RORc。与对照组相比，模型组中脾淋巴细胞中Tbx21、RORc的mRNA表达升高，GATA3、Foxp3的mRNA表达下降。在给予DLTH治疗后，Tbx21、RORc的mRNA表达下降，GATA3、Foxp3的mRNA表达上升，差异均具有统计学意义。与对照组相比，模型组Tbx21/GATA3、RORc/Foxp3升高，给药后比值降低，见Fig 5。

2.5 DLTH对CIA大鼠膝关节软骨的影响大鼠膝关节甲苯胺蓝染色病理学分析表明，与对照组大鼠相比，CIA大鼠膝关节软骨层软骨降解明显，DLTH给药后可以明显改善严重的软骨损伤，见Fig 6。

2.6 DLTH对CIA大鼠软骨中相关酶表达的影响MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5是在软骨降解起重要作用的酶。与对照组相比，CIA大鼠软骨层MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5的表达明显升高。在给予DLTH治疗后，MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5的表达都明显降低，见Fig 7。

2.7 DLTH对CIA大鼠软骨中炎症因子和基质金属蛋白酶基因表达的影响与对照组相比，模型组大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的表达量明显升高。在给予DLTH治疗后，这些炎症因子的表达量均明显降低。与对照组相比，CIA大鼠软骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5的mRNA表达显著升高。在给予DLTH治疗后，这些软骨相关降解基因的表达都显著降低，见Fig 8。

Fig 3 The pathological changes of spleen The yellow arrows indicate white pulp and the green arrows indicate germinal Scale bar=100 μm.**P<0.01 vs control group;#P<0.01 vs model group.

Fig 4 Expression of splenic lymphocyte *P<0.05,**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 5 Expression of splenic lymphocyte specific transcription *P<0.05,**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 6 Histological changes of knee **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.Scale bar=100 μm.

Fig 7 Effects of related enzyme expression in Red arrows indicate positive cells.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.Scale bar=100 μm.

Fig 8 Effects of inflammatory and matrix metalloproteinase genes expression in **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

3 讨论

RA是一种自身免疫性疾病，其主要特征是炎症引起的关节破坏。虽然目前尚无治愈 RA 的方法，但已经有多种药物可以用来减缓疾病发展的进程。目前临床上应用比较多的药物包括非甾体类抗炎药、糖皮质激素和抗风湿药物。糖皮质激素类药物虽然已被证明具有缓解疼痛的作用，但不能缓解疾病进展，且伴随的不良反应也令人不安。壳聚糖是一种天然多糖，具有生物相容性、生物降解性、无毒、生理惰性，并且对蛋白质有显著亲和力、耐细菌、止血等许多特性。由于其良好的生物相容性，壳聚糖被广泛用于制备微球制剂[5-6]。壳聚糖基材常用于药物递送领域，作为药物可持续释放的基材。特别是含有多种多元醇(如甘油、乙二醇和山梨醇)的壳聚糖，由于它们能够在特定靶点持续释放特定的药物，可作为注射性的凝胶，因此备受关注。这些多元醇可使壳聚糖保持液态，在酸性溶液中，多元醇在壳聚糖周围形成水的屏障，并在较高的pH值和较低的温度下保持壳聚糖的溶解度[7]。近年来，有研究报道，壳聚糖、高甘油钠或甘油和饱和硼砂溶液混合制备可形成温敏水凝胶[8]。因此，在温敏壳聚糖基材的凝胶载体研究中，甘油也受到了广泛的关注。硼砂常常被用作该温敏水凝胶体系的pH调节剂[9]。因此，我们选择壳聚糖-甘油-硼砂作为地塞米松的载体。壳聚糖-甘油-硼砂原位凝胶是一种优良的局部给药系统，是一种可注射的微创溶液，在局部给药后会随温度变化而变成半固态凝胶。DLTH通过直接注射到关节腔室，不仅能达到在关节处富集药物，降低全身毒性的作用，还能延长药物释放时间，提高地塞米松的治疗指数，降低不良反应风险。因此，本研究将探索地塞米松温敏凝胶关节腔内注射治疗后对RA的免疫调节和软骨保护作用。

RA起病的主要原因包括自身抗体形成，激活T细胞和B细胞，释放大量炎症因子，包括IL-1β、TNF-α。IL-1β、TNF-α参与全身炎症反应，导致关节组织破坏。并且，TNF-α的释放，可使巨噬细胞与促炎因子结合，进一步加重全身炎症。实验中，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平升高，DLTH给药后明显降低血清IL-1β、TNF-α含量，提示DLTH可改善RA全身炎症反应。脾脏是机体最为重要的免疫器官之一，可以准确反映机体的免疫情况。在实验中，对照组大鼠的脾脏病理切片显示，白髓和红髓界限分明，且被厚的纤维囊所包裹。而CIA大鼠的脾组织结构出现明显的扭曲且纤维囊变薄，大量生发中心形成。在给予 DLTH治疗后，脾脏病理性结构变化得到显著改善。脾脏在调节机体免疫的时候，还会通过调节Th细胞来调节机体免疫反应。作为CD4+Th细胞的四个重要亚型，Th1、Th2、Th17和Treg细胞与RA显著相关。RA患者的Th1/Th2比值增加，并且与疾病活动呈正相关[10]。RA疾病可能还会损害以Th17/Treg比值低为特征的Th17与Treg之间的平衡。因此，调节Th1/Th2和Th17/Treg失衡状态有利于治疗RA。本次研究发现DLTH可能通过抑制大鼠T细胞向Th1和Th17分化来调整Th1/Th2、Th17/Treg失衡状态,最终改变CIA大鼠免疫应答紊乱状态。

RA中免疫紊乱会导致炎症反应、软骨破坏等。炎性细胞因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17a，在关节炎中起非常重要的作用[11-12]。这些细胞因子表达的升高会刺激软骨或滑膜内的炎症细胞产生MMPs和ADAMTS。关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix,ECM) 组成，ECM主要是由组织液、胶原蛋白和蛋白多糖所组成。MMPs 是一类在ECM的降解过程中占据重要地位的蛋白酶超家族。MMPs 的表达增加与 RA 疾病的进展有显著的相关性。在各种MMPs中，MMP-3、MMP-9和MMP-13对胶原蛋白的降解最为重要。Tuncer等[13]研究发现，RA患者的血清中MMP-3的表达水平显著高于对照组，且软骨破坏严重。MacLauchlan等[14]研究发现，MMP-9表达的升高会增强破骨细胞的活性和形成从而导致软骨破坏。MMP-13过表达的转基因小鼠发生自发性的关节内软骨破坏，而MMP-13敲除小鼠会在软骨内骨化表现出明显的障碍[15]。ADAMTS是一种聚集蛋白聚糖酶，在软骨ECM的分解代谢中起着重要的作用[16]。ADAMTS的家族成员众多，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5跟关节软骨密切相关。Liacini等[17]研究发现，中药雷公藤F(tripterygium wilfordii Hook F，TWHF)可以抑制软骨细胞中 ADAMTS-4 的表达从而具有软骨保护作用。Glasson等[18]研究发现，ADAMTS-5的缺失会抑制关节炎模型中的软骨损伤。在本次研究中，CIA大鼠软骨破坏严重，且软骨细胞中炎症因子(IL-6、IL-17a、TNF-α、IL-1β)和降解酶(MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5)表达增加。在给予DLTH治疗后，软骨破坏现象明显减轻，且炎症因子和降解酶表达显著降低。

综上，通过体内研究证明DLTH对RA具有明显的免疫调节和软骨保护作用。因此，DLTH作为地塞米松的新剂型，可能为治疗RA提供一种更为有效和安全的方法。