热能分析仪法测定那屈肝素钙中N-NO基团含量的方法学研究

米文强，任风芝，刘建芬，张向彬，王彩肖

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050015；2.华北制药华坤河北生物技术有限公司，河北 石家庄 050000)

图1 那屈肝素钙的结构式

图2 N-NO加合物的结构式

欧洲药典(EP)提供了一个将N-NO基团转化为NO的化学过程，该方法使用氢溴酸在乙酸乙酯回流环境中使供试品脱去N-NO基团，产生的NO由氩气作为载气送入热能分析仪进行检测，进而计算供试品中N-NO基团的含量[1]。为保证检测方法有较高的灵敏度和较好的稳定性，该方法使用了-120 ℃及-160 ℃冷阱。EP规定那屈肝素钙中的N-NO基团限度为0.25 μg·mL-1。

参照EP方法，作者利用市售设备，采用乙酸乙酯回流液中的氢溴酸(用冰醋酸稀释至30%)将N-NO基团从反应物主链断下[5-7]生成NO；经氮气载运至检测器，与臭氧发生反应，生成具有荧光效应的NO2，进而被记录信号生成色谱图，进行那屈肝素钙中N-NO基团含量的测定，实验装置如图3所示。

图3 实验装置示意图

1 实验

1.1 试剂与仪器

那屈肝素钙，自制；N-亚硝基二丙胺(NDPA)对照品，Sigma；无水乙醇(色谱纯)；氨基磺酸(分析纯)；甲酰胺(优级纯)；氢溴酸(分析纯)；冰醋酸(分析纯)；乙酸乙酯(优级纯)；实验用水为超纯水，自制。

冷却循环泵；真空泵；臭氧发生器；800系列热能分析仪，英国Ellutia；超纯水机，美国Pall。

1.2 溶液的配制

反应液：称取氨基磺酸20 g置于烧杯中，加乙酸乙酯100 mL，搅拌至悬浊状态，放置3 d，经0.45 μm膜过滤，得到乙酸乙酯反应液；用冰醋酸将40%氢溴酸稀释至30%；取15 mL乙酸乙酯反应液与5 mL 30%氢溴酸混合，即得。

甲酰胺溶液：称取氨基磺酸10 g，溶解于190 mL甲酰胺和10 mL超纯水混合液中，即得。

NDPA对照溶液：取NDPA对照品1支(100 mg)，置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度；精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，得到NDPA对照贮备溶液；分别精密量取NDPA对照贮备溶液30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL置于10 mL容量瓶中，用甲酰胺溶液定容至刻度，得到不同浓度的NDPA对照溶液。

供试溶液：精密称取那屈肝素钙0.1 g，用1 mL甲酰胺溶液溶解，即得。

土地利用总体规划所确定的城市村镇建设用地，被称为“圈内用地”。为实施规划，需要占用圈内用地，涉及农用地的，应当办理农用地转用审批手续；涉及集体所有土地的，应当办理土地征收审批手续。在已批准的农用地转用范围内，具体建设项目用地由市、县人民政府批准，由市、县国土资源部门依法供应。

1.3 N-NO基团含量的测定

平衡系统，将超纯水、甲酰胺溶液、NDPA对照溶液、供试溶液依次进样，记录色谱图；绘制NDPA的标准曲线，由回归方程按下式计算供试溶液中N-NO基团含量(μg·mL-1)：

式中：c1为供试溶液中NDPA浓度，ng·mL-1；c为供试溶液浓度，g·mL-1；44为N-NO基团的分子量；130为NDPA的分子量；1 000为换算系数。

1.4 分析条件

氮气压力5 psi；氧气压力2 psi；灵敏度235；冷却液温度≤-20 ℃；液滴回流速度1～2滴·s-1；进样量50 μL。

2 结果与讨论

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性

将无水乙醇、冰醋酸、超纯水、甲酰胺溶液、供试溶液、60 ng·mL-1NDPA对照溶液依次进样检测，结果如图4所示。

图4 专属性实验

从图4可以看出，无水乙醇、冰醋酸、超纯水、甲酰胺溶液均不产生干扰峰，供试溶液主峰与NDPA对照溶液主峰一致，无显著差异。

2.1.2 线性范围

取30～180 μg·mL-1NDPA对照溶液依次进样，以NDPA对照溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线(图5)，拟合得回归方程：y=39.36+6.95x，R2=0.9991。表明NDPA浓度在30～180 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

图5 NDPA的标准曲线

2.1.3 灵敏度

取NDPA对照溶液进样检测，结果表明，当NDPA对照溶液浓度低至30 ng·mL-1(相当于供试品中N-NO基团含量约为0.17 μg·mL-1)时，S/N≈3，即检出限为30 ng·mL-1；当NDPA对照溶液浓度低至50 ng·mL-1(相当于供试品中的N-NO基团含量约为0.10 μg·mL-1)时，S/N≈10，即定量限为50 ng·mL-1。

2.1.4 精密度

配制74 ng·mL-1NDPA对照溶液，连续进样6次，峰面积分别为522.364、521.172、519.345、520.788、508.816、519.364，RSD=0.87%；取供试溶液连续进样6次，峰面积分别为379.157、381.164、388.827、385.520、392.386、393.448，RSD=1.38%。

平行配制6份供试溶液，平衡系统，按1.4条件进样检测，测得N-NO基团含量(μg·mL-1)分别为0.17、0.17、0.19、0.18、0.18、0.18，RSD=3.8%；变更实验员、检验日期，按重复性方法实验，进行精密度验证，测得N-NO基团含量(μg·mL-1)分别为0.18、0.18、0.17、0.17、0.18、0.18，RSD=3.3%。

2.1.5 加标回收率

精密称取那屈肝素钙约1 g，加入约相当于供试品中N-NO基团含量80%的NDPA对照品，用甲酰胺溶液定容至10 mL。同法配制100%、120%加样供试溶液，各平行3份，测定各溶液中N-NO含量，计算加标回收率，结果见表1。

表1 加标回收率

2.2 实际样品测定

自制3批那屈肝素钙，按1.2方法制备供试溶液，进样检测，测得N-NO含量(μg·mL-1)分别为0.17、0.18、0.18，均低于EP规定的限度0.25 μg·mL-1。

3 结论

经方法学验证，确定的热能分析仪法检测那屈肝素钙中N-NO基团含量的方法具有专属性好、灵敏度高、精密度好、准确度高等特点，且采用的仪器装置相比EP方法更为简单易控，适用于那屈肝素钙中N-NO基团含量的测定。受制于市售设备的标准，实验装置未能采用更低温的冷阱以进一步提高灵敏度[5]。