亚微米聚苯乙烯微粒粒度标准物质研制

赵晓宁，罗月，张国城，吴丹，霍胜伟，沈上圯

（北京市计量检测科学研究院，北京 100012）

随着科学技术的不断发展，医药、生物、材料、环境等学科逐渐由宏观向微观延伸，研究尺度向微米甚至纳米级别拓展。颗粒物标准物质作为测量技术中质量控制和量值传递的关键材料，在科学研究和工业生产中应用十分广泛［1］。目前计量领域使用的亚微米粒子有用于尘埃粒子计数器的粒径分别为0.3、0.5、0.7、1.0 μm 的聚苯乙烯粒子，和用于环境检测GB／T 18204.2–2014 《公共场所卫生检验方法第2 部分：化学污染物》的粒径为0.6 μm 的聚苯乙烯粒子［2］，以及粒径谱仪和尘埃粒子计数器校准用的粒径为0.3～1.2 μm 的聚苯乙烯粒子。

对于纳米级聚苯乙烯小球标准物质，目前美国国家标准与技术研究院开发了粒径为0.3 μm的SRM 1690 标准物质；美国赛默飞世尔科技公司开发的Duke 标准粒子是粒径为0.05～1.0 μm 的13 种标准物质；国防科技工业颗粒度一级计量站与北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司开发的5 种尘埃粒子计时器校准用标准物质，粒径分别为0.321、0.426、0.513、0.603、0.939 μm；中国石油大学重质油国家重点实验室与中国石油大学开发的8 种聚苯乙烯微球粒度标准物质，粒径分别为0.079 1、0.117、0.299、0.333、0.582、0.763、0.855、1.089 μm；中国计量科学研究院开发的10 种微粒粒度标准物质，粒径分别为0.065 2、0.084、0.115 1、0.209 1、0.280 3、0.424 5、0.487 2、0.709 3、0.776 2、1.294 μm。

聚苯乙烯微粒粒度标准物质的合成方法主要有乳液聚合法、分散聚合法、无皂乳液聚合法、微乳液聚合法、种子聚合法和溶胀聚合法等［3］。聚苯乙烯微粒粒度标准物质的定值方法主要有电子显微镜法（透射电子显微镜和扫描电子显微镜）、光学显微镜法、动态光散射法、电迁移法等［4］。

流行病学研究表明，大气颗粒物浓度的短期增加与呼吸系统疾病发病率有密切的关系［5–6］，而颗粒物的粒径是影响人体健康的一项重要参数，细粒子尤其是亚微米细粒子(空气动力学直径不大于1 μm 的颗粒物，PM1)比粗粒子呈现出更高的健康风险［7］。呼吸道疾病绝大多数是在有限空间内（相对密闭的室内环境或公共交通工具）感染并传播的，与室外环境相比，病原性微生物气溶胶在有限空间内的传播扩散机制对预防和控制呼吸道传染病更为重要。病原性微生物气溶胶（微生物本身或病源微生物附着在环境颗粒物上形成的）的物理特性，如粒子大小、数量、初始速度对于传播扩散具有重要影响，其中粒径对于疾病传播起决定性作用。环境微生物气溶胶粒子（细菌、真菌、孢子、花粉等）粒径为0.5～100 μm，病毒尺寸为20～300 nm［8–10］。微生物气溶胶的研究模式有实验室研究方法—直接使用微生物形成气溶胶，以及数值模拟方法—用流体力学计算微生物气溶胶在空气中运动轨迹或空间分布。实验室研究方法中微生物培养检测耗时长，且存在微生物感染的风险；数值模拟方法不能完全模拟微生物气溶胶在实际传播过程中的各种环境因素［11］。

利用标准粒子可以在环境模拟舱内模拟微生物气溶胶传播中的相关物理因素（微粒大小、在空间内浓度和空间分布），既可以获得病源微生物气溶胶传播性质，也可以避免较高的微生物感染风险，具有重要的现实意义。国内外虽然已经有不少可用于常规仪器计量检测的亚微米级的粒度标准物质，但要用于模拟30 m3微生物气溶胶空间或者更大的环境空间，目前亚微米级粒度标准物质的产量和价格均无法满足实际应用需求。

为满足国家市场监管总局及国家自然基金项目中大量使用亚微米标准物质需求，笔者采用无皂乳液聚合法及分散聚合一步合成法制备了粒径分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μm 的8 种规格的聚苯乙烯微粒粒度标准物质，经场发射扫描电子显微镜及图像分析软件对颗粒的直径进行测量，对标准物质的均匀性与稳定性进行检验，并对定值结果的不确定度进行评定。研制的聚苯乙烯微粒粒度标准物质具有良好的均匀性与稳定性，有效期为12个月。该系列标准物质符合国家二级标准物质要求，为后期开展模拟病源性微生物气溶胶传播的相关因素研究打下了良好的基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

场发射扫描式电子显微镜：蔡司Sigma300 型，德国卡尔·蔡司股份公司。

一维栅格标准样板：1 000 nm，中国计量科学研究院。

无水乙醇、氢氧化钠、过硫酸钾：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

苯乙烯、二乙烯基苯、聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈：均为分析纯，上海沪试实验室器材股份有限公司。

微粒粒度标准物质：标准值为1 280 nm，编号为GBW 12031，批号为202002，中国计量科学研究院。

1.2 仪器工作条件

放大倍率：300 00 倍；加速电压：5 kV；测微尺标准长度l：250.2 nm；测微尺测量长度L：253.3 nm；像素点宽度：3.9 nm。

1.3 标准物质制备

无皂乳液聚合：将一定量的水加入至500 mL三口烧瓶中，恒温水浴加热至70～75 ℃，然后加入一定量的过硫酸钾，并将一定量的苯乙烯单体滴加至反应体系中，控制搅拌速度，在氮气保护下反应24 h，得到单分散的聚苯乙烯微球乳液，通过控制苯乙烯单体含量得到粒径分别为0.3、0.4、0.5、0.6 μm的4 种聚苯乙烯微粒。

分散聚合：将一定量的聚乙烯醇和无水乙醇加入至500 mL 三口烧瓶中，待聚乙烯醇完全溶解后，将三口烧瓶置于恒温水浴中加热至70～75 ℃，根据所需要制备粒子大小，将一定量的苯乙烯单体、交联剂二乙烯基苯及引发剂偶氮二异丁腈加入至三口烧瓶中，控制搅拌速度，冷凝回流，在氮气保护下反应10 h，得到单分散的聚苯乙烯微球乳液。通过控制单体、交联剂、引发剂含量得到粒径分别为0.7、0.8、0.9、1.0 μm 的4 种聚苯乙烯微粒。

1.4 球形度检验

已合成的聚苯乙烯微球需进行球形度检验［12］，结果表明，8 种粒子的球形度分别为0.986、0.988、0.987、0.986、0.980、0.977、0.981、0.976，均大于0.95，符合要求［13］。筛选合格后的聚苯乙烯微球形态如图1 所示。

图1 筛选合格后的聚苯乙烯微球形态

1.5 均匀性检验

依据JJF 1343–2012 《标准物质定值的通用原则及统计学原理》［14］对聚苯乙烯微粒粒度标准物质进行均匀性检验。根据标签编号从已分装的200瓶标准物质中随机抽取12 瓶，从每瓶的上、中、下部随机抽取样品进行测定。采用单因素方差分析法，利用F 检验判断标准物质的均匀性。

1.6 稳定性检验

1.6.1 短期稳定性检验

短期稳定性考察了低温环境（5 ℃）及高温环境（60 ℃）下的稳定性。

将样品置于5 ℃恒温箱中保存，分别在第0、1、3、7、14 天取出进行测定。测量前，先将标准物质样品在室温条件下放置1 h，每瓶样品经充分混匀后随机抽取1 000 粒测定粒径，取1 000 粒的平均粒径作为一次测定的数量平均粒径。

将样品置于60 ℃恒温箱中保存，分别在第0、1、3、7、14 天取出进行测定。测量前，先将标准物质样品在室温条件下放置1 h，每瓶样品经充分混匀后随机抽取1 000 粒测定，取1 000 粒的平均粒径作为一次测定的数量平均粒径。

采用直线拟合法分别对低温和高温稳定性检验数据进行统计分析，并对短期稳定性检验结果进行评估。

1.6.2 长期稳定性检验

将样品置于室温环境中保存，分别在第0、1、3、7、12 个月取出进行测定。测量前，先将标准物质样品在室温条件下放置1 h，每瓶样品经充分混匀后随机抽取1 000 粒测定粒径，取1 000 粒的平均粒径作为一次测定的数量平均粒径。采用直线拟合法对检验数据进行统计分析，并对长期稳定性检验结果进行评估。

1.7 标准物质定值

样品由一排等大小的微球组成，颗粒的投影面积按式(1)计算：

式中：A——显微图像中颗粒的投影面积；

N——显微图像中单颗粒所占的像素；

δ2——显微图像中单颗粒所占的面积。

显微图像中单个颗粒半径、单个颗粒直径分别按式(2)和式(3)计算：

式中：Ri——单个颗粒半径，μm；

Di——单个颗粒直径，μm；

l——测微尺长度，μm；

L——测微尺在一定放大倍数下测定值，μm。

聚苯乙烯微粒粒度标准物质的数量平均直径按式(4)计算：

式中：Dmean——数量平均直径，μm；

n——测量颗粒的个数。

颗粒直径的标准偏差s 和相对标准偏差RSD分别按式(5)和式(6)计算：

扫描电子显微镜法是一种绝对测量方法［15–16］，参照国家标准GB／T 21649.1–2008 《粒度分析图像分析法 第1 部分：静态图像分析法》，在1.2 仪器工作条件下进行测定。经过图像分析后，计算颗粒的数量平均粒径、标准偏差、相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 均匀性检验

按照1.5 方法对制备的聚苯乙烯微粒进行均匀性检验。以粒径为1.0 μm 的聚苯乙烯微粒为例，测定结果列于表1。根据表1 数据，计算得组间差方和Q1=1.14×10–3，组内差方和Q2=1.99×10–3，组间方差S12=Q1／υ1=1.04×10–4，组内方差S22=Q2／υ2=8.30×10–5，统计量F=S12／S22=1.25，自由度υ1=11，υ2=24，查表得Fα=2.22，则F ＜Fα。同理计算其它7 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质样品的F 值，统计结果见表2。由表2 可知，8 种粒径的聚苯乙烯微粒粒度标准物质的F 值均小于Fα，表明制备的聚苯乙烯微粒粒度标准物质均匀性良好。

表1 粒径为1.0 μm 聚苯乙烯微粒粒度标准物质测定结果

表2 聚苯乙烯微粒粒度标准物质均匀性检验统计结果

2.2 稳定性检验

2.2.1 短期稳定性检验

按照1.6.1 方法对制备的聚苯乙烯微粒进行短期稳定性检验，8 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质数量平均粒径测定结果见表3，统计结果见表4。

表3 8 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质数量平均粒径测定结果 μm

表4 8 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质短期稳定检验统计结果

由表4 可知，8 种粒径的聚苯乙烯微粒粒度标准物质均满足|β1|＜t0.95，n–2s（β1），表明直线斜率不显著，研制的8 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质分别在低温（5 ℃）和高温（60 ℃）环境下贮存14 天，其特征量值是稳定的。

2.2.2 长期稳定性检验

按照1.6.2 方法对制备的聚苯乙烯微粒进行长期稳定性检验，8 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质数量平均粒径测定结果见表5，统计结果见表6。

表5 标准物质数量平均粒径测定结果 μm

表6 8 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质长期稳定检验统计结果

由表6 可知，8 种粒径的聚苯乙烯微粒粒度标准物质均满足|β1|＜t0.95，n–2s（β1），表明直线斜率不显著，研制的8 种聚苯乙烯微粒粒度标准物质在12个月内特征量值是稳定的。

2.3 不确定度评定

扫描电子显微镜测定颗粒物直径的数学模型如式(7)所示。

式中：D——待测颗粒的直径，μm；

l——测微尺的标准长度，μm；

L——测微尺在该放大倍数下测定值，μm；

R——待测颗粒在该放大倍数下的测定值。

根据JJF 1343–2012 《标准物质定值的通用原则及统计学原理》，标准物质的不确定度［17］由3 部分组成：定值引入的不确定度、均匀性检验引入的不确定度和稳定性检验引入的不确定度。其中定值引入的不确定度包括测微尺引入的不确定度、放大倍数校准引入的不确定度、测量待测颗粒引入的不确定度和取样误差引入的不确定度。

以上各不确定度分量互不相关，分别计算各不确定度分量并合成，得到标准物质定值的合成标准不确定度，结果见表7。

表7 不确定度度分量及合成标准不确定度 μm

按照有效数字修约原则进行修约，研制的聚苯乙烯微粒粒度标准物质特性量值见表8。

表8 聚苯乙烯微粒粒度标准物质特性量值 μm

3 测量方法验证

采用扫描电子显微镜对中国计量科学研究院研制的编号为GBW 12031 的国家一级微粒粒度标准物质进行测定，共统计1 000 颗颗粒数据，计算该标准物质的数量平均粒径、粒径分布的相对标准偏差，结果见表9。

表9 标准物质GBW 12031 测定结果

由表9 可知，测定结果与标准物质证书标示值基本一致，定值不确定度在给定的范围内，因此采用扫描电子显微镜对研制的聚苯乙烯微粒粒度标准物质定值，结果准确可靠。

4 结语

采用无皂乳液聚合法和分散聚合一步合成法制备了粒径分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μm 的8 种规格的聚苯乙烯微粒粒度标准物质，经场发射扫描电子显微镜及图像分析软件对颗粒的直径进行测量及分析，研制的系列聚苯乙烯微粒标准物质具有良好的均匀性和稳定性，已取得国家二级标准物质定级鉴定证书。该系列标准物质既可用于常规颗粒物在线监测仪、粒度分析仪等的校准、检定，也可以用于后续环境模拟舱内模拟微生物气溶胶传播中的相关因素研究。