基于阿尔茨海默症神经胶质细胞增生所致炎症反应的研究

祝绍峰，侯翌葳，孙阳，席思婕，孙剑明，姚宏波

齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

阿尔兹海默病是指患者伴有认知功能减退、 人格及行为障碍为特征表现一类神经系统病变疾病， 对其病理改变为脑内β 淀粉样蛋白沉积后形成老年斑，tau 蛋白过度磷酸化后形成神经元纤维缠结、神经元缺失[1]。 目前对发病机制尚不明确，经知晓其发病机制包括以下几类：Aβ沉积学说、遗传学因素及中枢胆碱能损伤学说等。 研究指出[2]，神经胶质细胞结构及功能异常变化，同样与阿尔兹海默病病理生理密切相关。 大量尸检结果表明[3]，阿尔兹海默病患者中合并严重局灶性炎症反应， 皮质及神经炎性斑中发现大量活化小胶质细胞、 星型胶质细胞及免疫反应产物，正常人群中无上述反应。 为此，2019 年7 月—2020 年1 月该实验选取16 只实验小鼠证实阿尔兹海默病与神经胶质细胞与炎症之间关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验选取雄性小鼠16 只，随机分为两组，各8 只。 年龄范围10~12 周，体质量264~310 g，平均（284.2±14.4）g。均为SPF 级，购自北京华阜康生物技术科技有限公司（动物合格证号0284311）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物处理将16 只小鼠分笼饲养，自然光照，标准喂养，所有小鼠均标准饲养7 d，对模型组小鼠，可双侧海马注射5 μL 凝胶态Aβ25~35，对照组小鼠，双侧位置注射5 μL 生理盐水。 动物痴呆模型制作：对小鼠腹腔内，可注射4%水合氯醛溶液1 mL/100 g，当麻醉后，将小鼠固定至脑立体定位仪上， 同时， 要求参考小鼠立体定位图谱，并对海马CA1 区定位，依据实验标准，并确定进针点并进针，位置上：前囟后3.50 mm，中缝左或右±2.00 mm，缓慢对颅骨脑硬膜平面注射2.7 mm，予以微量注射器，缓慢向双侧海马注入Aβ25~35，留针5 min，缝合伤口，术后予以青霉素抗炎。

1.2.2 生化检查两组小鼠均选取麻醉方式为水合氯醛（国药准字H34022125；规格5 mL），心脏内取血，将其保存至室温下30 min，4℃下，并以4 000 r/min 离心，经10 min 后并取上清液，保存在低温冰箱中。 酶联免疫吸附实验法检测两种炎性指标，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β），严格按照试剂盒说明书操作。 取血后，予以左心室灌注250 mL 生理盐水及含4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液，先快后慢，1 h 后并断头去脑部组织，沿着注射位置并切开冠状面，将其分为左右半脑，予以4%多聚甲醛固定过夜，脱水、透明、浸蜡，朝下包埋两块脑部组织，冠状切片，厚度为5 um，并染色开展免疫组化。硫堇染色法：沿着中间位置切开石蜡标本，并连续切片，后每隔4 张，抽取一张并予以二甲苯脱蜡，后梯度乙醇水合，蒸馏水进行冲洗，0.2%硫堇60℃水浴30~60 min 后，经冷却后，并采取梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 细胞计数法：抽取大脑皮层损伤程度最为严重小鼠，每组3 只，抽取2 张切片，并在光镜下观察，切片上，均予以2 个400 倍视野，开展神经细胞技术。 予以免疫组织化学技术，对胶质细胞及神经胶质原纤维酸性蛋白质表达检测。

1.3 统计方法

采用SPSS 18.0 统计学软件分析数据， 计量资料以（±s）表示，组间比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠Aβ 下致阿尔兹海默下大脑皮层神经元炎症情况下数量比较

硫堇染色后，对照组中小鼠皮层中，神经元表现上，以清晰、完整，突起明显、胶质细胞数量少。 模型组小鼠皮层中，神经元表现上，呈现减少、断裂及细胞不完整，此时以局部区域神经元坏死为表现（图1），模型组大脑皮层神经元炎症数量多于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组小鼠大脑皮层神经胶质细胞数量比较[（±s），个]Table 1 Comparison of the number of glial cells in the cerebral cortex of the two groups of mice[（±s），pcs]

表1 两组小鼠大脑皮层神经胶质细胞数量比较[（±s），个]Table 1 Comparison of the number of glial cells in the cerebral cortex of the two groups of mice[（±s），pcs]

组别神经胶质细胞数量模型组（n=8）对照组（n=8）t 值P 值516.65±24.26 105.65±14.26 41.310 0.001

2.2 两组小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平比较

模型组小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平高于对照组，两组差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平比较[(±s)，pg/mL]Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-1β between the two groups of mice[(±s)，pg/mL]

表2 两组小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平比较[(±s)，pg/mL]Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-1β between the two groups of mice[(±s)，pg/mL]

组别TNF-α IL-1β模型组（n=8）对照组（n=8）t 值P 值85.65±25.56 40.05±13.12 4.489 0.001 13.32±5.65 7.44±2.45 2.701 0.017

A 为模型组；B 为对照组A is the model group; B is the control group

3 讨论

阿尔兹海默病患者， 因脑部伴有持续、 慢性炎症反应，此时参与炎性反应细胞主要为神经胶质细胞。 部分研究指出[4]，若长期服用非甾体类抗炎药物，阿尔兹海默病发病率显著降低， 炎症反应往往参与阿尔兹海默病发病过程。小胶质细胞（MG）占据脑内所有胶质细胞5%~10%，其归为脑内单核-巨噬细胞系统。 一般情况下，多处于静息状态，当受到刺激后激活并吞噬、清除Aβ，从而降低Aβ 神经毒性，但另一方面，上述过程中会产生大量生物活性物质，伴随着细胞表面受体上调及炎性因子高表达，引起神经元凋亡、死亡，加速阿尔茨海默病进程[5]。 星形胶质细胞存在于阿尔茨海默病齿状回、 海马各区胶质纤维酸性蛋白阳性星型胶质细胞中，呈现上升趋势。 动物模型研究表明[6]，当星型胶质细胞激活后，此时机体内TNF-α过度表达后并产生慢性炎症反应， 引起一系列异常行为造成神经退行性病变。 少突胶质细胞作用可维持、保护神经元正常功能，当少突胶质细胞异常时，并造成中枢神经系统脱髓鞘病变，严重时引起神经元损伤。

目前多数研究证实[7]，对阿尔兹海默病患者而言，激活胶质细胞表达增加，其表达与胶质细胞活性为正比，此时胶质细胞增生，则表明中枢神经伴有一定程度损伤。 试验结果得出， 模型组小鼠注射Aβ25~35 后并进行硫堇染色，小鼠皮层神经元少，突起减少、断裂，细胞体表现不完整，局部区域神经元死亡，结果表明，对阿尔兹海默病小鼠模型而言， 自身中枢神经胶质细胞数量增多并伴有神经元损伤。 部分研究指出[8]，阿尔兹海默病患者脑内老年斑周围中，伴有大量活化神经胶质细胞及炎性因子，其疾病进程情况往往与神经退行性疾病病变联系紧密， 且伴有持续慢性炎性反应。 文章指出，模型组大脑皮层神经元炎症数量（516.65±24.26）个，多于对照组（105.65±14.26）个， 模型组TNF-α、IL-1β 分别为 （85.65±25.56）pg/mL、（13.32±5.65）pg/mL， 高 于 对 照 组 （40.05±13.12）pg/mL、（7.44±2.45）pg/mL(P＜0.05)。 研究表明[9]，另一项动物试验中，通过对神经损伤小鼠脑皮层神经元炎症数量、TNF-α、IL-1β 水平分别为（479.65±13.24）pg/mL、（84.42±21.25）pg/mL、（13.41±5.71）pg/mL 与 正 常 小 鼠 （104.56±13.78）pg/mL、（40.08±13.24）pg/mL、（7.51±2.51）pg/mL 对比显著偏高，进一步得出，神经损伤会进一步加重炎症反应，TNF-α 诱导神经毒性， 激活胶质细胞自分泌谷氨酸盐试验， 若机体TNF-α、IL-1β 水平进一步上升，反应痴呆严重程度，为一项辅助生物学诊断指标。 血清中， 若处于高水平TNF-α时，神经元自身伴有毒性作用，会协同IL-1 诱导，病程进展速度加快[10]。 总结试验观点指出，阿尔兹海默病患者胶质细胞激活，相对应脑组织神经胶质细胞数量上升，释放炎症因子并造成神经元损伤。 因此，对临床医师而言，对阿尔兹海默病患者需及时予以抗炎药物服用， 从而抑制脑内炎症反应，减缓病程进展。 神经胶质细胞在阿尔兹海默病中扮演着重要角色， 小胶质细胞及星形胶质细胞处于特定炎症介质调控下活化， 通过依赖性对中枢神经系统加以调节造成损伤。 胶质细胞所介导炎症，与阿尔兹海默病相关病变进展具有双重性， 不同学者对其治疗阿尔兹海默病途径进行研究中， 利用阿尔兹海默病相关动物模型开放及治疗方式取得显著成效[11]。目前对阿尔兹海默病疾病发病机制尚无完全定论， 仅知晓胶质细胞参与疾病发病过程，对检测诊断提供合理依据。 但由于阿尔兹海默病作为一类无法根治性疾病，因此，介于神经胶质细胞自身多功能特性， 将其作为对象进行研究为阿尔兹海默病未来可发展新方向之一[12]。由于该次实验仅开展小鼠实验，且实验目标数量、实验室条件限制，会影响整体实验数据，后续仍需加大样本量进一步证实论点。

综上所述， 阿尔兹海默病中小鼠神经元炎症细胞数量显著偏多， 胶质细胞及促炎因子释放会造成小鼠脑神经元损伤。