茵陈蒿汤抑制JAK2/STAT3信号通路调控肝癌细胞增殖与凋亡

谭章斌，丁文俊，徐由财，刘彬

肝癌是最常见的原发性恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因，其中在亚洲地区发病率与死亡率最高[1-2]。尽管在肝癌的早期发现、诊断和治疗方面取得了进步，但总体预后仍不理想，由于术后复发与转移，肝癌患者的5年生存期仍为20%～30%[3-4]。因此，继续寻找防治肝癌的有效药物将有助于改善肝癌的治疗。中草药已有数千年应用历史，由于其低毒性和良好的临床疗效，被认为是开发抗恶性肿瘤的最有希望的替代/补充药物之一[5]。茵陈蒿汤是临床常用的中药经方，据报道有抗肝癌作用[6]。然而，其抗肝癌作用的分子机制尚未完全了解。JAK2/STAT3信号通路激活对细胞正常生长至关重要，但包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中JAK2/ STAT3呈异常激活，驱动肿瘤细胞增殖、抗凋亡、侵袭与转移等多种生理学行为[7]。本研究探讨了茵陈蒿汤对肝癌细胞的抑制作用以及对JAK2/STAT3信号通路的调控。

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素、PBS缓冲液从美国Gibco公司购买。c-Myc(#18583，E5Q6W)、Bcl-XL(#2764，54H6)、p-JAK2(#4406，D15E2)、JAK2(#3230，D2E12)、STAT3(#30835，D1B2J)、GAPDH(#5174，D16H11)一抗从美国CST公司购买，p-STAT3(ab76315，EP2147Y)、Cyclin D1(ab134175，EPR2241)以及Mcl-1(ab243136，19C4-15)一抗从美国Abcam公司购买。 CCK-8、钙黄绿素/PI染色试剂盒从日本东仁有限公司购买。EdU染色试剂盒从广州锐博公司购买。

1.2 茵陈蒿汤制备

茵陈蒿、栀子、大黄提取物购买自西安开来有限公司，该公司已参照《中国药典》对所生产的中药提取物进行质量控制。生药 ∶提取物比例为10 ∶1，按照茵陈 ∶栀子 ∶大黄=3 ∶2 ∶1比例混合，使用双蒸水溶解三种中药提取物，过滤备用。

1.3 细胞培养

HepG2人肝癌细胞系从中国科学院上海细胞库购买。细胞常规培养在含有10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素的DMEM中，并在37 ℃、5% CO2的加湿培养箱中进行培养。

1.4 CCK-8检测肝癌细胞活力

将HepG2细胞(1×104/孔)接种在96 孔板，每组五个复孔，第2天加入10、20、30、40、50、60、80 μg/mL 茵陈蒿汤，在 37 ℃细胞培养箱继续孵育24 h，然后加入20 μL的CCK-8。吸光度通过微孔板酶标仪在450 nm波长处测量。采用SPSS 19.0软件计算IC50。

1.5 EdU染色检测肝癌细胞增殖能力

将HepG2细胞(1×104/孔)接种在96 孔板中培养，分为对照组和12.5、25、50 μg/mL茵陈蒿汤组(茵陈蒿汤给药浓度根据CCK-8实验结果进行设置)，继续培养24 h。根据试剂盒说明书，按如下步骤依次进行：EdU标记细胞、固定细胞、Apollo染色、DNA染色，最后使用荧光显微镜进行观察拍照。EdU阳性百分比= EdU阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.6 钙黄绿素/PI染色观察肝癌细胞存活

将HepG2细胞(1×104/孔)接种在96 孔板，分组同1.5，在37 ℃细胞培养箱继续孵育24 h，然后根据试剂盒说明，弃原培养基，加入钙黄绿素/PI混合液继续培养30 min，随后荧光显微镜观察拍照。

1.7 Western blot检测JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达

分组同1.5，干预24 h后每组细胞用PBS洗涤三次，用含有蛋白酶与磷酸酶抑制剂的细胞裂解缓冲液收集裂解细胞，然后12 000 rpm离心15 min。将收集的蛋白定量，每组取20 μg的蛋白质通过10%的SDS-PAGE分离，随后转移到聚乙烯氟化物膜(PVDF膜)。封闭后，PVDF膜在4 ℃下用p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Cyclin D1、c-Myc、Mcl-1、Bcl-XL(1∶1 000)和GAPDH(1∶3 000)的一抗孵育过夜。接着采用与HRP结合的二抗孵育膜，最后使用化学发光液进行检测。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 茵陈蒿汤抑制HepG2肝癌细胞增殖

为了观察茵陈蒿汤对肝癌细胞增殖的影响，在HepG2细胞上进行了CCK-8测定。结果如图1A所示，茵陈蒿汤以剂量依赖性的方式抑制细胞活性，24 h茵陈蒿汤处理的 IC50值为55.40 μg/mL。本研究进行EdU染色以进一步确认茵陈蒿汤对肝癌细胞增殖的影响。结果见图1B-C、表1，经过茵陈蒿汤处理后，肝癌细胞增殖数显著减少, 随着剂量的增加，细胞增殖能力进一步降低。12.5、25和50 μg/mL茵陈蒿汤组的EdU阳性细胞数分别为15.10%、11.80%和5.56%，显著低于对照组的37.60%(P<0.05)。

2.2 茵陈蒿汤促进HepG2肝癌细胞死亡

为了探索茵陈蒿汤抑制HepG2肝癌细胞增殖的作用机制，本研究进行了钙黄绿素/PI染色。绿色荧光为活细胞，红色荧光为死亡细胞。结果见图2、表2，茵陈蒿汤处理24 h后，活细胞数显著减少，死亡细胞数量显著增加。茵陈蒿汤以剂量依赖性的方式促进了HepG2肝癌细胞的死亡。12.5、25和50 μg/mL茵陈蒿汤组处理后的肝癌细胞死亡率分别为10.41%、12.60和21.06%，显著高于对照组的1.43%(P<0.05)。茵陈蒿汤通过抑制肝癌细胞活性，促进细胞死亡从而抑制肝癌增殖与生长。

图1 茵陈蒿汤抑制HepG2肝癌细胞增殖 A：CCK-8观察茵陈蒿汤对肝癌细胞活性的影响；B：EdU染色观察12.5、25和50 μg/mL茵陈蒿汤对肝癌细胞增殖能力的影响；C：EdU阳性细胞数比例。与对照组相比，*P<0.05

表1 各组EdU阳性细胞数比例

2.3 茵陈蒿汤抑制肝癌细胞JAK2/STAT3信号通路的激活

为了观察茵陈蒿汤抑制肝癌细胞增殖和存活的作用是否涉及JAK2/STAT3信号通路的激活，本研究分析了茵陈蒿汤处理后肝癌细胞中的p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3蛋白的表达水平。结果如图3A、表3所示，茵陈蒿汤显著抑制了JAK2和STAT3 的磷酸化水平，而总JAK2和STAT3蛋白表达没有明显变化(图3)。同时，本研究还检测了STAT3信号通路下游细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、c-Myc以及抗凋亡相关蛋白Mcl-1、Bcl-XL的表达。结果如图3B、表4所示，茵陈蒿汤浓度依赖性地抑制肝癌细胞中Cyclin D1、c-Myc、Mcl-1以及Bcl-XL的表达。这些数据表明，茵陈蒿汤通过抑制肝癌细胞中的JAK2/STAT3信号通路发挥抑制肝癌作用。

表2 各组细胞死亡率

图2 茵陈蒿汤促进HepG2肝癌细胞死亡 A：12.5、25和50 μg/mL茵陈蒿汤处理24 h后，活/死肝癌细胞染色图；B：死亡肝癌细胞比值。与对照组相比，*P<0.05

图3 茵陈蒿汤抑制肝癌细胞JAK2/STAT3信号通路的激活和下游增殖、抗凋亡相关靶蛋白的表达水平

表3 各组细胞JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达水平

表4 各组细胞JAK2/STAT3下游增殖与抗凋亡相关蛋白表达水平

3 讨论

多年来临床实践与现代药理学研究表明中药复方或中成药制剂具有良好的抗肝癌作用[8-10]。茵陈蒿汤最早记载于张仲景《伤寒论》中，千百年来常被应用于治疗湿热黄疸，近现代医家广泛地将其应用于治疗肝胆疾病[11]。现代药理学研究进一步发现茵陈蒿汤具有保肝、抗肝纤维化、增强免疫以及抗肿瘤等作用[12-14]。华永庆等[15]通过细胞固相色谱法探索茵陈蒿汤内有效活性成分的抗肝癌作用，发现4-羟基-3, 5-二牻牛儿基-苯丙烯酸等成分能够抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖，可能是茵陈蒿汤抑制肝癌的物质基础。李木松等[16]发现加味茵陈蒿汤能够通过激活线粒体途径诱导细胞凋亡，从而抑制HepG2肝癌细胞皮下移植瘤的生长。本研究发现茵陈蒿汤能抑制肝癌细胞活性，促进HepG2肝癌细胞死亡从而抑制肝癌细胞增殖。结合既往的临床和实验研究发现茵陈蒿汤有保护肝和抗肝纤维化作用，本文认为茵陈蒿汤在治疗肝癌方面有效且安全，有可能被开发为一种新的肝癌预防/治疗中药治疗剂。

JAK2属于Janus激酶(JAKs)家族成员之一，是一类细胞内非受体蛋白酪氨酸激酶[17]。JAK2是多种细胞因子或激素信号的关键细胞内转导蛋白，能被包括干扰素、生长激素、白介素-6和瘦素在内的多种细胞因子受体激活，几乎在每一种细胞类型中表达[18]。STAT3是JAK2的下游底物，JAK2激酶的激活会导致STAT3蛋白在C-终端域磷酸化从而激活STAT3，活化的STAT3可以将信号从细胞质传输到细胞核，并参与关键细胞功能的基因转录，以调节几个关键功能，如细胞增殖、存活、转移和分化等[19]。异常激活的JAK2/STAT3在包括肝癌在内的多种肿瘤细胞中被检测，驱动多种肿瘤细胞恶性生理功能[20]。因此，JAK2/STAT3信号通路被认为是肝癌治疗的潜在作用靶点之一。使用小分子抑制剂抑制JAK2/STAT3信号通路的激活可以诱发凋亡，抑制肝癌细胞体内外的生长[21]。茵陈蒿汤中的多种有效成分具有抑制JAK2/STAT3信号通路的作用。研究发现茵陈蒿的有效成分茵陈色原酮通过抑制STAT3 激活抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖与转移[22]。大黄的有效活性成分大黄素能够通过抑制JAK2/STAT3信号通路抑制体内外肝癌细胞的增殖与生长[23]。栀子的有效活性成分绿原酸能够通过抑制JAK2/STAT3激活，抑制LPS诱导的细胞炎症[24]。本研究发现茵陈蒿汤作用24 h后，HepG2肝癌细胞内p-JAK2和p-STAT3水平显著下降。异常激活的STAT3会引起增殖相关蛋白Cyclin D1、c-Myc的持续表达，诱导肿瘤细胞持续生长。Bcl-XL和Mcl-1是由STAT3调控转录的两种抗凋亡蛋白，其过度表达可以抑制肝癌进展期间的凋亡[25]。本研究发现在HepG2肝癌细胞中，茵陈蒿汤下调了Cyclin D1、c-Myc以及Bcl-XL、Mcl-1蛋白表达水平。这些结果表明，茵陈蒿汤对肝癌细胞增殖、存活的抑制作用是通过抑制STAT3，靶向抑制STAT3下游Cyclin D1、c-Myc和Bcl-XL、Mcl-1的表达而发挥的。

综上所述，本研究发现茵陈蒿汤通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活，以及下游增殖和抗凋亡相关蛋白的表达抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞死亡，发挥抗肝癌作用。茵陈蒿汤可以开发成为一种安全有效的预防/治疗肝癌中药治疗剂。