微小染色体维持蛋白6在肾透明细胞癌早期诊断及预后判断中的意义

宋乐乐 纪萌 王钧平 唐昊 吴金生

【摘要】 目的：探讨微小染色体维持蛋白6（MCM6）在肾透明细胞癌（ccRCC）早期诊断及预后判断中的意义。方法：应用TCGA数据库中533例ccRCC患者的RNA测序（RNAseq）数据，从RNA水平初步分析MCM6的mRNA表达与ccRCC早期诊断及预后的关系。应用免疫组化（IHC）实验方法从蛋白质层面分析MCM6蛋白在373例ccRCC患者的表达与ccRCC早期诊断与预后的关系。结果：分析TCGA数据库发现，ccRCC患者的MCM6高表达与肿瘤进展和生存率低均有关（P<0.001）。对373例ccRCC组织的免疫组化分析表明MCM6蛋白在ccRCC的癌旁正常组织中几乎不表达，而在ccRCC的肿瘤细胞中明显表达。Kaplan-Meier生存分析显示MCM6蛋白是ccRCC患者生存的不利因素，高表达MCM6的ccRCC患者预后差（P<0.001）。Cox回归分析结果显示，MCM6是ccRCC的独立预测因子（P<0.001）。MCM6受试者工作特征曲线下面积（AUC）值为0.604（P=0.001）。结论：MCM6是ccRCC患者生存的不利因素，MCM6是一种潜在的ccRCC早期诊断及判断预后的新型标志物。

【关键词】 肾透明细胞癌 MCM6 早期诊断 预后

[Abstract] Objective： To investigate the significance of microchromosome maintenance protein 6 （MCM6） in early diagnosis and prognosis of clear cell renal cell carcinoma （ccRCC）. Method： Using the RNA sequencing （RNAseq） data of 533 ccRCC patients in the TCGA database， the relationship between the mRNA expression of MCM6 and the early diagnosis and prognosis of ccRCC from the RNA level was analyzed. Then immunohistochemical （IHC） method was used to analyze the relationship between the expression of MCM6 protein and the early diagnosis and prognosis of ccRCC in 373 patients with ccRCC. Result： Analysis of the TCGA database showed that the high expression of MCM6 in patients with ccRCC was associated with low tumor progression and low survival rate （P<0.001）. The immunohistochemical analysis of 373 cases of ccRCC tissues proved that MCM6 protein was almost not expressed in the adjacent normal tissues of ccRCC， but was expressed in tumor cells of ccRCC. Kaplan-Meier survival analysis showed that MCM6 protein was an unfavorable factor for the survival of ccRCC patients， and the prognosis of ccRCC patients with high expression of MCM6 was poor （P<0.001）. Cox regression analysis showed that MCM6 was an independent predictor of ccRCC （P<0.001）. The area under receiver operating characteristic curve （AUC） of MCM6 was 0.604 （P=0.001）. Conclusion： MCM6 is an unfavorable factor for the survival of patients with ccRCC， MCM6 is a potential marker for early diagnosis and prognosis of ccRCC.

[Key words] ccRCC MCM6 Early diagnosis Prognosis

First-authors address： Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Weifang 261000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.09.006

腎细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）标准化年龄发病率排在全球第16位，死亡率在第17位，男女发病比例约为1.7︰1[1]，且近年来发病率和死亡率均呈上涨趋势[2]。肾透明细胞癌（ccRCC）是临床中最常见的肾癌类型，大约占肾癌比例的75%[3]。ccRCC起源于肾单位的近曲小管，其特征是细胞质透明的恶性上皮细胞[4]。在大部分慢性肾细胞癌中，Von Hippel-Lindau（VHL）基因丢失与缺氧信号的失调导致了多种基因激活[5]。其中血管内皮生长因子（VEGF）及其受体和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）仍然是系统治疗的主要靶点[6]。针对VEGF或mTOR信号转导的治疗药物，如索拉非尼、替西罗莫司、依维莫司、卡波替尼和乐伐替尼等先后成功开发并用于临床[7]。然而，这些药物仅能部分改善慢性肾细胞癌的预后，对晚期肾细胞癌的疗效仍然有限[8]。然而，在临床实践中几乎没有ccRCC的预后标记物[9]。因此，为了更好地治疗这种疾病，需要积极寻找新的预后标记物和指导个体化治疗的新靶点，以便使患者获得早期治疗和更精确的进一步治疗，从而延长生存期。

微小染色体维持基因（MCM）在DNA复制中起重要作用，包括六个高度相关的同源亚基（MCM2-7），构成了真核生物DNA复制解旋酶的催化核心[10]。研究表明，MCM基因在各种癌症中发挥重要作用，尤其是在癌症诊断和预后预测方面[11]。多项研究表明，MCM6在多种恶性肿瘤中表达增强，且与患者的诊断和预后密切相关，如乳腺癌、肝癌、胶质瘤等[12-14]。本研究主要检测了MCM6在ccRCC组织中的表达情况以及分析了MCM6在ccRCC中的早期诊断意义和预后意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及标本来源 从RNA和蛋白质两个方面综合分析MCM6在ccRCC中的表达意义。RNA水平的研究，从TCGA数据库获取了533例ccRCC患者的RNAseq数据;蛋白质水平的研究，选取373例ccRCC患者的免疫组化实验。标本来源：随机选取2008-2018年中国医学科学院北京肿瘤医院收治的术后病理结果证实为ccRCC的手术标本373例。标本包括肿瘤组织和癌旁正常肾组织，并以癌旁正常肾组织为对照。本研究肾癌临床分期采用了2010年AJCC第七版标准，其中为方便研究，Ⅰ期和Ⅱ期归为低分期，Ⅲ期和Ⅳ期归为高分期。采用1992年Fuhrman核分级的标准，对其进行组织学分级，其中为方便研究，G1和G2归为低级别，G3和G4归类为高级别。

1.2 主要试剂与仪器 MCM6兔抗人多克隆抗体（13347-2-AP）购自美国Proteintech公司，通用二步法检测试剂盒（PV9000）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显微镜DM2000购自德国莱卡公司。

1.3 组织芯片的构建和IHC实验

1.3.1 组织芯片的构建 首先根据标本数量设计合适的芯片微阵列，对组织标本进行固定、包埋等制作供体蜡块。供体蜡块切片做HE染色，根据HE染色标记供体蜡块。在供体蜡块上标记处打孔采集组织芯（每个病例包含3个癌组织芯和2个癌旁正常肾组织芯作为对照），将组织芯填充到受体模块，经压实、包埋固定制成组织芯片模块。对组织芯片模块进行连续性切片，再将切片转移到防脱载玻片上制成组织芯片，-20 ℃保存备用。

1.3.2 IHC实验步骤 采用通用二步法免疫组化检测方法。组织芯片经组织固定、脱蜡、水化、PBS浸洗后置入95 ℃的枸橼酸钠缓冲液（pH值6.0）中，微波加热进行抗原修复。PBS浸洗后滴加PV-9000试剂1（内源性过氧化物酶阻断剂），室温孵育10 min进行灭活。PBS浸洗后滴加一抗（MCM6兔抗人多克隆抗体1︰100稀释），对照组仅滴加等量抗体稀释液，然后4 ℃过夜孵育。PBS浸洗芯片后滴加PV-9000试剂2（反应增强液）室温孵育20 min，PBS浸洗后滴加试剂3（增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物）即二抗室温孵育20 min，然后经洗涤、DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片。

1.4 IHC染色结果判定 由三名有资质的病理医生分别进行阅片，阅片人员对组织芯片排列顺序及患者详细信息并不知情，评分有差异的再由三人以少数服从多数原则共同判定。评定标准：IHC染色分数是通过将染色面积分数（0=无细胞阳性，1=1%～25%，2=26%～50%和3=51%～100%）乘以染色强度分数（0=无染色，1=弱染色，2=中度染色和3=强染色）。根据组织芯片的染色评分结果，将ccRCC病例分为MCM6低表达组：MCM6低/无表达（≤6分）和MCM6低表达组：MCM6高表达（>6分）。

1.5 随访 随访信息包含患者门诊随访及电话随访，起止时间2008年3月-2019年12月，中位随访时间40个月，死亡70例，生存303例。

1.6 统计学处理 应用Medcalc软件对数据进行统计学分析，计数资料采用字2检验;应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线、对数秩检验（Log-rank test）进行生存曲线比较;采用单因素和多因素Cox回归分析来评估MCM6蛋白与ccRCC临床病理参数之间的关系;通过绘制受试者工作特征曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）来评价MCM6表达对ccRCC早期诊断的价值。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCM6 RNAseq数据分析 首先分析了TCGA数据库（http：//cancergenome.nih.gov）中公布的533例ccRCC患者MCM6的RNAseq數据，应用Medcalc软件绘制ROC曲线，并获取最佳截断值对MCM6的RNAseq数据进行分组，将其分为MCM6高表达组175例（32.83%）和MCM6低表达组358例（67.17%）。应用Kaplan-Meier生存曲线从RNA水平分析MCM6的表达与ccRCC患者生存和预后的影响，MCM6为ccRCC患者预后的不利因素，高表达MCM6的患者生存率低（P<0.001），见图1。

2.2 MCM6表达与临床病理特征的关系 MCM6低表达组性别、年龄与MCM6高表达组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;MCM6低表达组临床分期、组织学分级及术后复发进展情况与MCM6高表达组比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。见表1。

2.3 MCM6蛋白的表达 MCM6蛋白在ccRCC组织中的阳性表达并且主要表现在细胞核中，而在细胞质极少表达。在正常组织中近曲小管几乎没有阳性表达，远曲小管有少量表达，由于远曲小管不属于ccRCC来源细胞，故可忽略不计。对照组结果均为阴性。经统计，373例ccRCC组织的免疫组化实验中MCM6蛋白的阳性率及高表达率分别为60.1%（224/373）和30.3%（113/373），见图2。

2.4 生存分析

2.4.1 MCM6蛋白表达对患者预后的影响 采用Medcalc软件将MCM6蛋白在ccRCC中的表达绘制生存曲线，观察MCM6对ccRCC患者生存的影响，结果表明：MCM6蛋白的过表达是ccRCC患者生存的不利因素（P<0.001）。这里的结果与TCGA数据库中MCM6 RNAseq数据结果一致。见图3。

2.4.2 单因素Cox回归分析 采用单因素Cox比例风险模型分析MCM6蛋白的表达与各项临床、病理参数对ccRCC患者的生存影响，结果显示：较大肿瘤（直径>4 cm）、发生远处转移、高级别TNM临床分期（Ⅲ期和Ⅳ期）、高级别组织学分级（G3期和G4期）以及MCM6蛋白高表达等因素均是ccRCC患者的生存的危险性因素。见表2。

2.4.3 多因素Cox回归分析 排除无关变量和无意义变量，将对患者预后有意义的单变量纳入多因素分析。多因素分析结果显示，高级别临床分期、高级别组织学分级和MCM6蛋白高表达均是ccRCC患者预后的独立危险因素，见表3。

2.5 MCM6蛋白表达对ccRCC的诊断意义 对373例

ccRCC患者的MCM6蛋白表达IHC结果进行二分类，阳性：高表达组113例（30.3%），阴性：低/无表达组260例（69.7%），采用Medcalc软件绘制ROC曲线，对应的曲线下面积AUC值为0.604（P=0.001），95%置信区间为（0.552，0.654），敏感度和特异度分别为47.14、73.60。AUC值大于0.5，说明MCM6蛋白表达对肾透明细胞癌患者具有潜在的诊断价值。见图4。

3 讨论

研究表明在MCM2-7复合物中，六个亚基具有相互作用并紧密相关。在各种癌症的预后中也发现了MCM家族的相互关系。作为肝细胞癌预后预测的指标，MCM2-7、MCM8和MCM10彼此显著相关[15]。生存分析和联合效应分析表明，Ki-67、MCM3和MCM7是鉴别良性和恶性肾上腺皮质肿瘤的可靠增殖和诊断指标[16]。两种或两种以上上调的MCM的组合表明在肾细胞癌中有较短的无病生存时间[17]。众多研究表明，MCM成员积极参与生理和肿瘤过程。调控失调的MCMs被认为是通过破坏基因组稳定性和促进细胞周期进程来驱动癌症的，这两种因素都会显著促进细胞的异常增殖，从而增加癌症的风险[18]。因此，异常表达的MCMs可能成为早期诊断、预后甚至预测疗效的敏感肿瘤生物标志物。然而，仍有几个重要问题需要解决，首先对MCM在恶性肿瘤中的調控机制还缺乏深入的研究，如MCM成员在癌症中的上游调控因子是什么，它们如何通过转录或转录后机制调节MCM成员的表达？另外，目前还没有能直接靶向MCM蛋白的有效药物用于临床。但是，随着对MCMs的深入研究，可以期待未来将开发出有前途的抗癌策略，并为肿瘤患者提供益处。

在本研究中，笔者研究了MCM6在肿瘤组织中的定位和肿瘤进展中的意义，发现正常肾组织内几乎无MCM6蛋白表达，而在肾癌组织中明显高表达。MCM6在ccRCC组织中的表达与性别、年龄无关，而与临床分期、组织学分级以及是否复发和进展明显相关。本研究证实在mRNA水平的533例ccRCC临床样品中和在蛋白质水平的373例ccRCC组织中MCM6的上调并验证了其与ccRCC患者的不良预后相关。本研究还证实MCM6对ccRCC具有一定的早期诊断意义。但是，本研究仍然存在一些不足：仅研究了RCC中最常见的类型，乳头状细胞癌、嫌色细胞癌等其他少见类型未纳入研究;未统筹分析MCM2-7中的其他基因/蛋白与ccRCC的关系;由于目前随访时间的限制，未能获得MCM6对ccRCC的更远期的影响;MCM6与目前报道过的标志物之间有无相互关系以及有无协同作用等有待进一步研究。

综上所述，MCM6的高表达对ccRCC患者生存是一个不友好的指标，MCM6是一种潜在的ccRCC患者预后不良的标志物，且对ccRCC具有一定的早期诊断价值。

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（收稿日期：2021-01-15） （本文編辑：程旭然）