青蒿槟榔复方防治鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株感染的研究

曹玉娟，黄杰，黄俊杰，刘明江，李金贵*

(1. 通州湾示范区农业农村工作办公室，江苏 南通 226331；2. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009)

由柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)引起的鸡的盲肠球虫病，其造成的危害在鸡的常见7种艾美耳球虫中是最严重的[1]。柔嫩艾美耳球虫感染的严重程度取决于一次摄入的卵囊量，虫体寄生于鸡盲肠上皮细胞内，可引起鸡腹泻、血便、生长迟缓、饲料转化率降低等临床表现。多数情况下，盲肠球虫病往往呈现暴发性急性经过，数天之内死亡率可达30%～50%，甚至更高，给家禽养殖业造成巨大的经济损失[2]。目前，使用抗球虫药是防治球虫病的常用手段之一。然而，药物的长期使用会导致球虫产生耐药性并引起鸡肉等产品中药物残留，进而影响公共健康和食品安全[3]。多年来的实践证明，中药相对化学药物有诸多优点：如毒副作用小、价格低廉、不易产生耐药性和药物残留等，有望为药物防治鸡球虫病开辟一条新的途径[4]。本研究以柔嫩艾美耳球虫感染肉仔鸡为球虫病模型，以槟榔、青蒿、赤石脂、白术等5味中药进行组方，分别以汤剂饮水和散剂拌料开展该处方防治球虫的效果研究，结果表明中药预防组取得了较好的疗效，现将试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要药物

地克珠利溶液，天津市保灵动物保健品有限公司生产，批号20181003；青蒿槟榔复方由槟榔2份、青蒿1份、白术1份、黄连1份、赤石脂1份按重量配比而成，中药饮片均购自北京时珍堂药业有限公司。

1.2 试验动物和试验虫体

90只1日龄黄羽肉鸡购于中国农业科学院家禽研究所，饲养鸡舍经氨水喷洒及甲醛熏蒸消毒，确保试验环境无球虫等影响因素。采用40 W灯泡照明，自由饮水摄食，用不含抗球虫药的全价雏鸡料饲养至13日龄供试验使用。

球虫卵囊分离自南通某养殖场自然发病鸡盲肠，且发病鸡小肠无明显病变，综合判定其为柔嫩艾美耳球虫卵囊。按黄兵等[5]所述，对该分离株进行笼饲试验，计算该虫株在地克珠利作用下的病变计分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)、最适抗球虫活性百分率(POAA)、抗球虫指数(ACI)，结果显示4项指标均呈现耐药，表明该分离株对地克珠利重度耐药。

1.3 试验分组和设计

13日龄时对试验鸡进行称重，筛选体重在95 g以上的鸡70只随机分为7组，每组10只，即：空白对照组、感染对照组、地克珠利预防组、中药散剂预防组、中药散剂治疗组、中药汤剂预防组和中药汤剂治疗组。除空白对照组外，雏鸡饲养至14日龄时，每只鸡灌服6×104个孢子化卵囊，其中预防给药组于13日龄给药，连续给药4 d；治疗组于灌服卵囊后72 h后开始给药，连续给药4 d。中药散剂采用打粉后以10%拌料给药，汤剂则用等量药物进行煎煮后饮水给药。

1.4 卵囊计数及计算卵囊值

接种后120 h开始每24 h收集各组粪便，将每组粪便样品搅匀后取1 g，加10 mL去离子水悬浮，用麦克马斯特计数法进行卵囊计数，每组重复3次，计算平均值，连续收集4 d，4 d的卵囊数总和记作该组每克粪便中的卵囊数，即OPG[6]。卵囊数(×106)范围在0～0.1、0.1～1.0、1.1～1.9、2.0～5.9、6.0～10.9以及大于11所对应的卵囊值(oocyst index, OI)分别为0、1、10、20、30和40。

1.5 试验鸡增重、存活率以及药物抗球虫指数分析

试验过程中记录鸡的死亡情况，感染后192 h对每组鸡进行空腹称重，剖杀暴露盲肠，按文献[7]的方法评定盲肠病变记分，将病变记分×10作为病变值，并结合卵囊值、相对增重率和存活率计算抗球虫指数(ACI)。

相对增重率%=各组鸡的平均增重/健康对照组鸡的平均增重×100；

存活率%=组内存活只数/组内参试鸡总数×100；

ACI=(相对增重率+存活率)-(病变值+卵囊值)。

1.6 盲肠病变及扫描电镜观察

盲肠病变记分后采集盲肠中段，用PBS溶液冲洗干净后放入2.5%戊二醛固定液4 ℃固定2 h以上；PBS漂洗3次；梯度乙醇(30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ)脱水各15 min；先后经体积比1∶1的乙酸异戊酯无水乙醇和乙酸异戊酯处理各30 min以除去乙醇；在 CO2临界点干燥后进行LeicaSCD500刻蚀镀膜仪喷金处理；最后XL-30 ESEM环境扫描电镜观察[8]。

1.7 数据统计与分析

试验数据以“平均值±标准误”表示，运行Graphpad prism 6.01软件运行单因素方差分析(One-way ANOVA)对各组数据进行统计分析，P<0.05作为组间差异显著性的判断标准。

2 结果

2.1 体重变化

由表1可以看出感染对照组增重最少，相对增重率最低，只有53.96%；地克珠利预防组相对增重率略高于感染对照组，达到66.28%；中药散剂治疗组的相对增重率达到74.68%，与中药汤剂治疗组的效果相接近，相对于感染对照组有较大提升。增重效果最好的是中药散剂预防组，该组鸡体重相对增重率最高，达到了93.81%，而中药汤剂预防组则达到了86.55%。这说明中药复方对于鸡球虫病的预防效果好于治疗效果。

表1 中药复方以及地克珠利对鸡增重的影响

2.2 卵囊数检测

球虫感染对照组的卵囊数从第6天开始增加，到第8天时(192 h)明显增多，OPG可达到8×106个；地克珠利预防组卵囊数变化趋势与感染对照组相同，其OPG仅次于感染对照组，近7×106个；中药散剂预防组和汤剂预防组的OPG变化趋势接近，相较于感染对照组大幅下降，是所有组中OPG最低的2组；中药散剂治疗组的OPG为5×106个，而汤剂治疗组的为3×106个。这说明使用中药预防明显减少了卵囊的生成，并与相对增重的结果吻合。空白组、感染对照组、地克珠利预防给药组、中药散剂治疗组、中药散剂预防组、中药汤剂治疗组和中药汤剂预防组所对应的卵囊值分别为0、30、30、20、10、20和10。

2.3 肠道病变

感染球虫120 h后，感染对照组、地克珠利预防组、中药散剂治疗组和汤剂治疗组均出现血便，2个预防用药组则未见血便。鸡剖杀后分离盲肠，可发现空白组鸡的盲肠无外观病变；感染对照组病变明显，盲肠变短但肿大，外观浆膜面呈深红色，且有明显盲肠芯；地克珠利预防组的盲肠也变短，并有盲肠芯存在，肿大程度较感染对照组略轻；2个中药治疗组的盲肠也明显变短，但无盲肠芯；中药散剂预防组的盲肠外观接近空白对照组。各组盲肠外观病变见图1。

图1 各组鸡盲肠病变情况

2.4 抗球虫指数

从存活率来看，感染对照组、地克珠利预防组和中药散剂治疗组都存在试验鸡死亡，存活率为90%。中药散剂预防组和汤剂预防组的ACI分别达到176.76和165.12，说明预防给药的抗球虫效果均达到良好水平；而感染3 d后用药的中药散剂治疗组和汤剂治疗组的ACI分别为126.35和132.88，但相对于感染对照组也有改善，而地克珠利预防组几乎无治疗效果。具体结果见表2。

2.5 扫描电镜

如图2所示，空白组的肠道光滑平整，无卵囊和球虫寄生，肠道微绒毛无损伤；感染对照组的肠道上有较多卵囊存在，微绒毛破坏严重；地克珠利预防组的肠道损伤也比较严重，存在较多卵囊，肠道微绒毛减少、萎缩；中药散剂和汤剂治疗组以及对应的预防组肠道组织都可以发现少量球虫卵囊，相较感染对照组与地克珠利组明显减少。4个中药组的肠道损伤明显减轻，微绒毛等结构相对完整。

表2 中药复方抗盲肠球虫病效果评价

图2 各组盲肠组织扫描电镜观察(红色箭头为球虫卵囊)

3 讨论

本试验使用了地克珠利耐药株进行的感染结果显示该中药复方预防给药对球虫感染具有很好的抑制感染作用，其ACI达到160以上的良好水平；治疗用药也有一定的效果，但效果较差；而地克珠利几乎无效，较好地说明了对于耐药虫株，使用中药预防用药有望实现对盲肠球虫病的有效控制。该中药复方由青蒿、槟榔、白术、赤石脂等组成。按传统功效青蒿具有截疟作用，槟榔则具有行气破滞、促消化功能，白术可健脾燥湿，而赤石脂则能够收敛止血止泻，故几个药物联合使用较好地达到了预防球虫感染作用。

近年来以青蒿组成中药复方开展的抗球虫研究较多，如青蒿、鹰爪风、山茶根、黄柏等组成的中药复方可以增加球虫病鸡的存活率[9]；河南黑马动物药业有限公司生产的青蒿散能缓解柔嫩艾美耳球虫感染所致的盲肠组织病变，减少粪便中卵囊的排出量，并呈现剂量依赖性，混饲高剂量(500 mg/kg)青蒿散组的ACI达到137[10]。现代研究发现青蒿中的青蒿素是非常有效的疟原虫抑杀剂，鸡球虫和疟原虫同属顶复器门原虫，两者有相似的繁殖特性。故推测青蒿素对球虫病也有抑制作用，试验证明单用青蒿素对鸡球虫病防治确有一定效果，青蒿素对球虫的第二代裂殖子微线基因有显著的抑制作用，促进第二代裂殖子凋亡，从而减少卵囊的产生，并可抑制球虫感染引起的炎症反应[11]，这应该是本方能够发挥抗球虫疗效的物质基础之一。青蒿内除了青蒿素外，可能还含有其他具有抗球虫功效的物质，这是因为青蒿干燥叶片的抗球虫效果好于纯青蒿素给药组[12]。目前已知青蒿素不耐高温且不溶于水[13]，但与组方内其他药物混合煎煮时可能有助于有效成分的溶出，但青蒿素却易被煎煮温度破坏，这可能是拌料给药的效果略好于汤剂饮水效果的原因。

此外，该组方中的槟榔也具有较好的抗球虫感染作用，试验表明在雏鸡日龄中混饲给予600 mg/kg槟榔提取物预防柔嫩艾美耳球虫耐药株引起的球虫病的ACI可达到140[14]。在本试验中，将青蒿、槟榔联合使用，并配合健脾燥湿止泻的药物，使ACI达到了170以上，体现了配方药物之间具有良好的协同作用，并对地克珠利耐药株起到了良好的预防感染作用。下一步可对此复方进行拆方对比研究，进一步优化该处方并逐步明确发挥药效的关键物质，对中药抗球虫新药的开发具有重要意义。