1例猪链球菌5型感染者分离菌的病原学诊断、分型及相关基因的检测

李曲文,罗宏活，黄梦颖，谢芳钦，林震宇，徐海滨，翁顺太

猪链球菌最早见于荷兰 (1951)和英国(1954)报道，是一种能引起猪脑膜炎、关节炎、心内 膜炎、败血症和肺炎的病原菌，并可以引起人的感染，是一种呈世界广泛分布的人兽共患病[1]。 猪链球菌根据荚膜多糖抗原的不同共分为33个血清型。在猪和人体以猪链球菌血清型2型最常被分离到且是致病力最强，不同的血清型也不断的被发现可以引起人的感染，如血清1/2 、7 、9 、14，31 等也能引起人猪链球菌感染[2]。本文通过实验室诊断对1例猪链球菌5型的病例进行诊断及分子分型分析，阐述如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 菌株分离来自福建三明邓某某血液培养分离菌株。

1.2主要试剂和仪器 血平板、VITEK2全自动微生物分析系统、GP卡、革兰染色液购自广东环凯公司，α-氰基-4-羟基肉桂酸基质(HCCA)购自德国 Bruker 公司，甲酸、乙腈和三氟乙酸购自美国Sigma 公司。 分子生物学试剂购自TaKaRa宝生物工程有限公司，引物序列及测序均由铂尚生物技术有限公司完成，MALDI-TOF MS -Microflex TM LT 型(德国Bruker公司)。

1.3方法 通过血培养分离可疑菌株，并对分离菌株进行涂片革兰染色镜检及常规的生化鉴定以及常规PCR鉴定猪链球菌属基因(16SrRNA)、猪链球菌33(1～31型,33型,1/2型)种血清型基因鉴定；猪链球菌毒力相关的谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (gapdh)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)及毒力相关序列(orf2)等基因、质谱鉴定等等。MLST分型用PCR扩增aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳后测序。序列经提交MLST网站(http://pubmlst.org/ssuis/)，确定序列分型(SequenceType,ST)型别，各基因引物序列见表1、表2，参考文献[3-5]。

表1 猪链球菌基因检测引物Tab.1 Primers for gene detection of Streptococcus suis

表2 7个管家基因引物Tab.2 Primers for seven housekeeping genes

2 结 果

2.1革兰染色结果 革兰阳性球菌

2.2生化鉴定 VITEK2 GP 卡，89%为猪链球菌1型/87%猪链球菌2型。

2.3基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF- MS)鉴定结果：鉴定分值 (ScoreValue)为2.03(极好的鉴定为猪链球菌)。质谱峰图见图1。

图1 质谱峰形图 Fig.1 Peak shapes of the mass spectrum

2.4药敏实验结果 对氨苄西林、氨苄青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、万古霉素、替加环素等抗生素体外药敏实验均为敏感；而对氯霉素和四环素两种药物显示为耐药。

M:DL2000;1.16S rRNA；2.cps5；3.ef；4.mrp；5.sly；6.gdh；7.gapdh；8.fbps；9.orf2图2 猪链球菌的检测电泳图Fig.2 Electropherogram of Streptococcus suis detection

2.5猪链球菌相关基因及毒力基因鉴定结果 菌株猪链球菌相关基因鉴定结果：16SrRNA(+)cps5(+)，并经与NCBI上猪链球菌Cps5序列比对与strain:11538序列100%相似。提示该菌株为猪链球菌血清型5型；毒力基因携带模式：ef(-)mrp(+)sly(+)gdh(+)gapdh(+)fbps(-)orf2(-)。电泳结果见图2、3。

图3 Cps5序列比对结果Fig.3 Cps5 sequence alignment results

2.6MLST结果aroA-cpn60-dpr-gki-mutS-recA-thrA基因等位基因谱为8-30-5-45-44-22-109，经比对序列分型，型别为ST373。7个基因电泳结果见图4。

M:DL2000;1：aroA;2：cpn60;3：dpr;4：gki;5：mutS;6：recA;7：thrA图4 MLST电泳图Fig.4 Electropherogram of MLST

3 讨 论

猪链球菌是一种可以从猪传染人的病原体，主要通过皮肤伤口感染。虽然猪链球菌有33个血清型，但并不是所有的血清型都能引起人的感染，2型是最常见的致病血清型，也是我国主要的流行菌株，但其他血清型如1，1/2，7，9，31等均有陆续的报道人感染猪链球菌[6-8]。对菌株的快速、准确鉴定以及相关的分子诊断分析对于疫情处置和临床诊疗具有重要的临床意义。

如何快速的对分离株的鉴定是实验室首要任务，通过传统的细菌常规分离培养、生化鉴定该菌株为阳性链球菌，VITEK 2-compact分析系统是近年来由梅里埃研发的可简便、快速鉴定猪链球菌的一种方法。本文中分离到的菌株通过VITEK 2-GP生化鉴定提示89%为猪链球菌1型/87%猪链球菌2型，为进一步验证鉴定结果，经MALDI-TOF- MS质谱鉴定其鉴定分值为2.03，极好的鉴定结果判定为猪链球菌属。为进一步了解菌株所属的血清基因型别，因血清凝集实验经常会出现血清交叉凝集现象，故而本实验直接经常规PCR进行猪链球菌属基因(16SrRNA)及以聚合酶链反应(PCR)为基础的荚膜分型糖(CPS)对猪链球菌的33(1～31型,33型,1/2型)种血清型基因分型结果为16SrRNA阳性、CPS5阳性，判断为猪链球菌血清型5。

为了解福建省首次分离到的这一株猪链球菌5型病例菌株的致病性，分析了ef、mrp、sly、gdh、gapdh、fbps、orf2等毒力基因。由于不同的毒力基因编码的蛋白具有不同的功能，mrp基因是编码胞外因子的有助于细菌突破血脑屏障，而ef是一种粘附素，能黏附上皮细胞并诱导上皮细胞融合和凋亡，MRP和EF是判断猪链球菌其毒力强弱的重要毒力因子，本次分离到的菌株为mrp+/ef-/,表明该菌株为弱毒株；sly基因编码的溶血素是具有溶血活性且可破坏微血管内皮细胞和上皮细胞，有利于细菌在组织中的侵袭扩散，同时谷氨酸脱氢酶(GDH)是细菌能量代谢的一个重要分子，也是诊断猪链球菌感染的一个重要诊断因子和具有免疫保护抗原。甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)是一种糖酵分解反应酶，具有增强细胞骨架结构、促进细菌与宿主细胞之间的信号转导作用[8-9]，sly+/gdh+/gapdh+ 3个基因均为阳性表明菌株具有在感染组织内侵袭并导致宿主的致病性。而fbps基因表达的是纤连蛋白和血纤蛋白原的结合蛋白(fbps)，fbps参与细菌粘附、定植和感染的重要基础[10]，毒力相关序列orf2在强弱毒株之间的序列存在差异，这两个基因均为阴性，这种差异可能与菌株致病性有关[11]。不同菌株的毒力基因携带模式并不一定相同，此次血培养分离株猪链球菌毒力基因携带模式：mrp+/ef-/sly+/gdh+/gapdh+/fbps-/orf2-，与实验室以往分离的猪链球菌2型菌株具有一定的差异性，需要进一步的分析及今后的动物实验以验证毒力基因跟致病性的相关性。

本研究同时还对猪链球菌的7个管家基因(aroA-cpn60-dpr-gki-mutS-recA-thrA)进行分析，经提交网站(http://pubmlst.org/ssuis/)分析得出该菌株的等位基因谱为8-30-5-45-44-22-109，序列分型为ST373型别。人感染猪链球菌血清型5型报道比较少，在泰国、瑞典、美国、日本曾有报道过，但此次分离菌株的MLST型别为ST373，与泰国分离ST181和日本ST752型别不一样，非同一来源菌株[10-12]，且也不是我国分离株常见的ST7型或者ST1型，应该引起我们今后工作中的重视。同时为了解该猪链球菌5型菌株的药物敏感情况，通过体外药敏实验提示对氯霉素和四环素耐药，对氨苄西林、氨苄青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、万古霉素、替加环素等药物为敏感，与文献报道的其他猪链球菌耐药结果基本一致[13-16]。

综上所述，福建省此次分离到的猪链球菌血清型5型，也提示了5型也可以引起人体感染，应加以重视。虽然生化鉴定及质谱分析均能鉴定到猪链球菌属，但如需要进一步分析到血清型，可采取PCR方法对荚膜分型糖(CPS)进行血清型基因鉴定，并可测定相关的毒力基因判断强弱毒株，同时由于MLST方法可以快速实现互联网共享，可用于对猪链球菌5型的分子流行病学分析。

利益冲突：无