急性胃黏膜损伤家兔耳胃穴组织学与超微结构变化的研究

游丽梅 ，刘海玲 ，刘继洪 ，龙翔宇 ，徐光镇 ，蒲永棚

（1.广州中医药大学，广州 510405；2.广州中医药大学附属佛山中医院，佛山 528000；3.佛山健翔医院，佛山 528000）

急性胃黏膜损伤（acute gastric mucosal injury，AGMI）是机体在严重创伤、烧伤、休克、感染以及内脏功能严重受损等多种危重情况下发生的以胃黏膜糜烂、溃疡、出血为主要特征的急性应激性病变[1]。作为临床危重疾病的常见并发症，掌握AGMI的预防与治疗手段至关重要。西医学主要通过抑酸、防酸返流、抗氧自由基、抗细胞黏附因子、促进胃黏膜细胞修复等药物来进行治疗，但仅起到保护胃黏膜层的作用且不良反应明显，无法完全控制 AGMI的疾病进程[2]。中医学的临床方法广泛，涉及中药、艾灸、针刺等方面[3-5]。有研究发现，在 AGMI的进程中，炎症反应是其溃疡难以愈合及易复发的主要原因[6]，而通过刺激耳穴对胃有兴奋和抑制的双向效应，能够改善内脏血供从而促进胃黏膜上皮细胞的再生[7-8]。本研究通过观察耳胃穴组织学和超微结构改变，探究AGMI的炎症反应与耳胃穴组织结构变化之间的内在联系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级健康成年新西兰家兔 20只，普通级，体质量（2.0±2.5）kg，实验动物使用许可证号为 SYXK（粤）2018-0002，由广东省医学实验动物中心提供并且繁育饲养。单笼饲养，按需喂颗粒饲料（由广东省医学实验动物中心提供），自由饮水，采用每12 h昼夜交替照明，室温（21±2）℃。动物检疫结束后，按照体质量进行编号，采用随机数字表法随机分为模型组和正常组，每组10只。本实验涉及的与动物实验相关的内容和程序遵从国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[9]及该机构实验动物伦理委员会的相关规定。

1.2 主要试剂及仪器

0.1 M磷酸缓冲液（国药集团，货号P-3813）；盐酸赛拉嗪（吉林省敦化市圣达动物药品有限公司，批号20180801）；戊巴比妥钠（德国默克，批号 170108）；环保透明剂（武汉宏兹生物技术有限公司，批号20190325）；环保封片胶（武汉宏兹生物技术有限公司，批号 20190610）；锇酸晶体（美国 TEDPELLA公司，货号18456）；乙醇溶液（广东光华股份有限公司，批号20190621）；100%丙酮溶液（国药集团 ，货 号191105-1）；2%醋酸双氧铀染色液（美国EMS公司，货号22400）；柠檬酸铅（美国 TEDPELLA 公司，货号 19314）；Epon812树脂（美国 TED PELLA公司，货号 GP18010）；石蜡（广东大川特种蜡有限公司，批号 20171202）；曙红（天津市天新精细化工开发中心，批号 20180306）；苏木素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号F162039）。山之峰（Shan Zhi-feng， SZF）健康检查笔（河南山之峰信息科技股份有限公司，SZF201812211）；生物组织包埋机 （LEICAEG1150）；轮 转 切 片（LEICARM2235）；超薄切片机（徕卡 UC-7）；光学显微镜（奥林巴斯 BX41）；透射电子显微镜（日本电子株式会社生产JEM-1400 PLUS）。

1.3 模型制备与鉴定

两组家兔禁食48 h后，模型组采用无水乙醇溶液灌胃进行造模（剂量为每公斤体质量2.35 mL无水乙醇溶液）[10]，正常组采用与模型组相同体积的纯净水进行灌胃。取模型组所有家兔的胃黏膜组织，经苏木精-伊红（HE）染色，在光镜下进行胃黏膜组织病理学检查，确定模型成功。

1.4 耳胃穴定位

耳胃穴的定位是在文献[11-14]与前期预实验运用电测法及病理检查的基础上确定。耳胃穴位于耳轮脚末端，耳甲艇和耳甲腔交界的上方。预实验采用本实验相同的造模方法，于造模成功后48 h，用SZF健康检查笔对家兔耳胃穴及周边进行电测，观察并记录低电阻点。局部组织经 HE染色，在光镜下观察各点组织结构，进一步确定耳胃穴准确定位。电测结果显示显著低电阻点位于家兔耳廓耳轮脚A、B、C点，见图1。选取周围皮肤同等低电阻点为非耳胃穴，（图1中位于B点上方1 cm，横嵴下方，耳中动脉旁近耳甲艇处）。根据光镜结果，选取最强阳性反应点B点为耳胃穴（本研究提及的耳胃穴均为B点）。

图1 新西兰家兔耳廓耳轮脚分区示意图

1.5 采样处理

灌胃48 h后，麻醉两组家兔（每公斤体质量肌肉注射3%戊巴比妥钠溶液1 mL），再用空气栓塞法处死。用锋利刀片切取肉眼病变最明显处的胃黏膜组织 1～2块（共约2 cm×3 cm）、左侧耳胃穴和非耳胃穴组织（约1 cm×1 cm），和右侧耳胃穴组织（米粒状，约为1 mm×1 mm×1 mm）。

1.6 指标检测

1.6.1 胃黏膜炎症评分[15]

对家兔胃黏膜 HE染色切片进行光学显微镜观察并进行胃黏膜炎症评分。无胃炎为0分；轻度为1分（局部充血、轻度炎症）；中度为2分（严重充血、局部炎症明显）；重度为3分（全胃弥漫性炎症变化）。

1.6.2 耳胃穴组织炎症分级[16]

对家兔耳胃穴组织 HE染色切片进行光学显微镜观察并进行炎症分级评价。无明显炎症为少量散在炎细胞；轻度为少数炎细胞浸润；中度为较多炎细胞浸润，表皮轻度增厚；重度为多数炎细胞浸润，表皮增厚明显。

1.6.3 组织的病理学观察

取两组左侧耳胃穴组织、非耳胃穴组织和胃黏膜组织标本，置于 10%中性甲醛溶液中固定，再进行修块、流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋等操作，石蜡切片、HE染色和封片后，置于光学显微镜下观察并记录组织病理学变化。

1.6.4 超微结构观察

取两组右侧耳胃穴组织用生理盐水漂洗，滤纸吸干，置于滴有 2.5%中性戊二醛电镜固定液的平皿中，放在充满 2℃～8℃的 2.5%中性戊二醛溶液电镜固定液的冻存管中，再放置于4℃冰箱内保存。完成组织标本清洗、用1%锇酸固定、梯度脱水、树脂渗透包埋、固化、半薄切片定位、50～70 nm厚超薄切片、铀铅双染色等步骤，置于透射电子显微镜（transmission electron microscope， TEM）下观察耳胃穴组织的超微结构并拍摄耳胃穴组织的整体（×5 000）照片以及局部（×30 000）照片。

1.7 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。胃黏膜炎症评分比较采用独立样本 t检验，耳胃穴组织炎症程度及非耳胃穴组织炎症程度比较采用卡方检验。以 P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胃黏膜组织病理形态和炎症评分比较

模型组可见局部胃黏膜糜烂、出血，黏膜层单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞浸润，黏膜下层水肿、单核细胞及中性粒细胞浸润；正常组未见明显异常变化，部分正常组家兔出现胃黏膜的轻度炎症反应可能因灌胃操作造成的实验性应激性胃黏膜损伤[10]。详见图 2。表明本实验造模方法合理且可成功复制。

图2 两组胃黏膜病理形态比较（HE染色，×200）

与正常组比较，模型组胃黏膜炎症评分明显升高，组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。详见表1

表1 家兔胃黏膜组织病理观察

2.2 两组耳胃穴组织病理形态和炎症分级比较

模型组耳胃穴组织可见表皮角质层疏松，局部变薄，表皮（棘层、基底层）及真皮增厚，局部真皮致密结缔组织排列疏松及炎症细胞浸润；正常组未见明显变化，详见图3。模型组胃黏膜组织与耳胃穴组织病理形态比较，发现随着胃黏膜组织炎症程度的加重，耳胃穴组织的炎症程度也相应加重。模型组中，胃黏膜炎症程度分级与耳胃穴组织炎症程度分级比较，存在个体差异。模型组耳胃穴组织的炎症程度明显高于正常组，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。详见表2。

图3 两组胃黏膜和耳胃穴组织病理形态比较（HE染色，×200）

表2 两组耳胃穴组织炎症分级比较

2.3 两组非耳胃穴组织病理形态和炎症分级比较

两组各有 9例的非耳胃穴组织未见异常变化，两组各有1例出现非耳胃穴组织局部表皮增厚、真皮层单核细胞及中性粒细胞浸润，详见图4。模型组非耳胃穴组织炎症分级与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

图4 两组非耳胃穴组织病理形态比较（HE染色，×200）

表3 两组非耳胃穴组织炎症分级比较

2.4 两组耳胃穴组织超微结构比较

正常组家兔耳胃穴组织结构未见异常，可见角质细胞排列紧密，大量结构正常的桥粒。模型组家兔胃黏膜发生轻度炎症时，耳胃穴组织可见胞浆角蛋白丝聚集，细胞间隙增宽，大量结构正常的桥粒，胞浆线粒体轻度肿胀。模型组家兔胃黏膜发生中度炎症时，耳胃穴组织可见细胞间隙增宽，少量结构正常的桥粒，胞浆角蛋白丝聚集，线粒体肿胀、空泡变性。模型组家兔胃黏膜发生重度炎症时，耳胃穴组织可见细胞间隙增宽，胞浆角蛋白丝聚集，少量结构不清的桥粒，胞浆线粒体肿胀、空泡变性以及线粒体自噬。随着胃黏膜炎症程度的加重，耳胃穴超微结构的变化更明显。详见图5。

图5 两组耳胃穴组织超微结构比较

3 讨论

《灵枢·口问》：“耳者，宗脉之所聚也。”依据中医学经络学说，六阳经都直接或间接地上耳前或耳中，六阴经则通过与阳经的络属关系间接地与耳发生联系，脏腑的生理或病理活动均可通过经络反映于耳。中医学认为人体是有机统一的整体，当某个部位发生病变时，在耳廓的相应穴区上会出现阳性反应点。刘继洪等[17]运用B超或胃镜等现代医学诊断手段证实“定位穴”（即阳性反应点）与腹腔脏器相对应的关系。西医学认为耳廓是一个具有独特的局部反应整体全息的微观世界。Montazeri M等[18]通过对伊朗德黑兰心脏中心的冠心病患者对耳垂皱褶进行评估，得出斜角耳垂皱褶可作为诊断冠心病的指标。中、西医学在耳廓反应点的认识上不谋而合，通过阳性反应点来推断疾病的部位进行治疗，在临床上具有一定的指导意义[19]。既往实践研究表明，针刺耳胃穴可改善胃血液循环障碍，促进胃黏膜上皮细胞的再生[20]，这提示耳胃穴与胃黏膜之间存在某种关联机制。据此，本实验以AGMI的炎症反应为切入点，探究急性胃黏膜损伤家兔胃黏膜的炎症反应与耳胃穴组织学和超微结构变化的内在联系。

正常兔耳菲薄、柔软，其上可见清晰的毛细血管，而脏腑发生病变时，耳廓的相应部位上出现变色、变形、血管充盈、脱屑或丘疹等变化，即为阳性反应。通过观察这些阳性反应点的组织，可发现与脏腑病变相关的耳穴发生皮肤角化层变薄，甚至消失，棘层增生变厚，局部出现大量的炎性细胞浸润等组织学变化[21-22]。本研究中，模型组耳胃穴组织学表现为角质层疏松，局部变薄，局部表皮（棘层和基底层）及真皮增厚，真皮致密结缔组织排列疏松，单核细胞及中性粒细胞浸润等病理改变，而正常组没有明显改变。同时，模型组与正常组的非耳胃穴未出现异常改变，这说明模型组耳胃穴组织出现炎症反应，病理结构改变符合阳性反应点的组织变化，且该变化不存在于其他部位。

此外，耳胃穴组织电镜下有不同程度的超微结构变化，主要表现在桥粒与线粒体的改变。桥粒为上皮细胞特有的一种细胞间黏着结构，通过张力丝发挥细胞与细胞间的连接作用来维持细胞间黏附力，从而保持细胞形态，抵抗机械刺激，维持组织的完整性。当皮肤出现炎症反应时，可出现桥粒数量的减少和结构的破坏[23-24]。正常组电镜下可见大量结构正常的桥粒，而模型组桥粒明显减少，甚至部分结构不清。同时，炎症的发生、发展与线粒体功能密切相关，线粒体不仅可以调控固有免疫细胞中的炎症反应，也可以作用于炎症介质从而介导炎症的产生。大量的炎症因子不仅可以改变细胞的生理状态，而且可以影响线粒体的融合与分裂，使线粒体的功能和结构都发生巨大的变化[25]。线粒体常见的病理改变是线粒体肿胀，线粒体极度肿胀时可转化成小空泡状结构，当线粒体进一步受损，就会激活线粒体自噬这一自我保护机制，选择性清除受损伤或多余线粒体以维持细胞稳态[26]。模型组耳胃穴组织电镜下可见胞浆线粒体肿胀、空泡变性及线粒体自噬。桥粒和线粒体的这些改变可表明耳胃穴组织出现炎症反应。

正常胃黏膜细胞对损伤有一定的抵抗能力，而损伤的形成与各种细胞因子和炎症介质有关，在各种细胞损伤因子的作用下，胃黏膜发生炎症并产生大量的炎症因子，造成中性粒细胞浸润[27]。随着胃黏膜炎症程度的加重，急性胃黏膜损伤家兔耳胃穴组织学和超微结构变化更明显，耳胃穴作为胃黏膜损伤的阳性反应点，主要表现为组织的炎症反应。以上说明耳胃穴的炎症反应机制可能与 AGMI胃黏膜损伤机制存在某种关联。

本文通过对急性胃黏膜损伤家兔耳胃穴的组织学及超微结构的观察，明确了耳胃穴诊治胃部病变的价值。耳穴指导临床诊治疾病疗效显著，但由于耳穴与机体之间存在着极其复杂的多层次、多途径的联系[28-29]，其内在机理至今尚未明确。基于中西方不同的起源及理论背景，耳穴基础研究的丰富与完善弥足重要。借助现代医学理论在细胞及超微结构的微观层面来解释耳穴作用原理，能够达到中西医的交融贯通，从而提高医者的诊疗水平，促进外界对“耳穴医疗”的认可与接受[30]。