2 型糖尿病患者糖尿病视网膜病变与外周血衰老CD8+T细胞及炎症指标的相关性研究

张梦洁，周济，潘天荣，钟兴(通信作者)

（1.安徽医科大学第二附属医院内分泌科，安徽 合肥 230601；2.安徽医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫学系，安徽 合肥 230032）

0 引言

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是一种进展性的复杂的糖尿病微血管并发症，也是导致当今成年人不可逆失明最常见的病因。至今其发病机制尚未明确，长期慢性高血糖是DR 的发病基础[1]。近年来，炎症或免疫反应因素在DR 中的作用日益受到重视。免疫衰老对慢性炎症的发生发展起到不可或缺的推动作用，并与各种与年龄相关的代谢性疾病和免疫紊乱有关。共刺激分子受体CD 28 的缺失和CD 57 表达的增加是人类CD8+T 细胞衰老免疫系统的重要标志[2,3]。据研究表明，衰老CD8+T 细胞可以产生大量促炎细胞因子和细胞毒性介质，与高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死等慢性炎症疾病的发病机制密切相关[4]。尽管有证据表明免疫衰老会导致糖尿病的发生发展[5]，但没有研究评估CD8+T细胞衰老增加是否与DR 有关。本研究旨在探讨外周血衰老CD8+T 细胞频率与DR 的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018 年1 月至2019 年5 月安徽医科大学附属第二医院内分泌科住院的127 例T2DM 患者为研究对象，其中男性69 例，女性58 例，均符合1999 年WHO 制定的糖尿病诊断标准。所有患者均行眼底检查，根据2002 年国际眼病学会制定的DR 分级标准[6]，由眼科专科医生根据眼底照相结果诊断患者是否为DR，并分为两组：非DR 组(NDR 组)46 例，男25 例，女21 例，平均年龄（50.5±9.6）岁；DR 组41 例，男22例，女19 例，平均年龄（56.5±5.5）岁；同期体检中心经年龄和性别匹配后随机选取健康体检者为对照组（NC 组）40 例，男22 例，女18 例，平均年龄（51.0±5.8）岁。排除标准：1 型糖尿病及其他特殊类型糖尿病患者；T2DM 伴急性并发症；肝肾功能不全及恶性肿瘤病史患者；近1 个月内服用降脂药物和噻唑烷二酮类药物患者；因视盘周围大血管不清晰及眼底检查图像模糊而不能确诊患者；白内障、青光眼等患者；有吸烟史及长期大量饮酒史、因各种原因无法配合检查患者。本研究通过安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准（YJYX2020-004），研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料

收集患者一般临床资料如年龄、性别、糖尿病病程、吸烟饮酒史等；受试者清晨脱鞋、免冠，测量身高、体重、腰围，精确度为0.01m 和0.1kg，并计算体质指数（BMI）=体重（kg）/身高2（m2），休息0.5h 后平卧位测量右上肢血压三次取其平均值。收集肝肾功能、血脂、空腹血糖、空腹胰岛素、血常规等生化指标。计算中性粒细胞／淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）和血小板／淋巴细胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）。

1.2.2 流式细胞检测及实验室检查

采集T2DM 患者及健康对照者外周静脉血2mL，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。取流式试管1 个，分别加入CD57-异硫磺酸荧光素（FITC）、CD28-藻红蛋白荧光素（PE）、CD4-别藻蓝蛋白（APC）、CD8-藻红蛋白- 德克萨斯红（ECD）、CD3-紫草素叶绿素（PerCP）、CD45-(Pacific blue) 等抗体各2ul（均购自美国BD 公司），再加入抗凝血50ul，混匀。避光温育15min 后，加入2mL 氯化铵溶血，静置10min 后上流式细胞仪检测（美国Beckman Coulter 流式细胞仪）；应用Cyto FLEX 软件获取并分析，计算外周血中CD3+CD8+CD57+CD28-占CD8+T 淋巴细胞比例；全自动生化检测仪采用ELISA 检测血清生化及其他指标。检测前常规对流式细胞仪进行光流路质量调控和荧光补偿，使仪器各项指标在质量控制允许值范围 。检测时首先根据前向 (FSC)和侧向(SSC)散射光信号对淋巴细胞群进行设门，每份标本获取设门内细胞在10000 个以上，检测后数据以Listmode 文件形式保存。

1.2.3 胰岛β 细胞功能评估

以标准馒头餐负荷试验评估胰岛β 细胞功能，使用胰岛素治疗后空腹血糖控制在10 mmol/L 以下时行标准馒头餐负荷试验。葡萄糖氧化酶法测定空腹及餐后2 小时血糖，化学发光法（罗氏诊断，瑞士）检测空腹及餐后2 小时血清C 肽。胰岛素敏感指数（homeostasis assessment insulin sensitivity ,HOMA2-ISI）、胰岛β 细胞功能指数（homeostasis model assessment 2-%β，HOMA2-%β）和胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA2-IR）使用HOMA2 软件计算，软件下载网址为http://www.dtu.ox.ac.uk。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0 软件进行统计学分析，计数资料组间采用卡方检验。正态分布的计量资料以±s 表示，非正态分布数据用中位数（上下四分位数）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析和非参数检验进行两两比较。Spearman 相关分析衰老T 细胞水平与临床指标的相关性。Logistic 回归分析T2DM 合并DR 的影响因素。以P＜0.01 或P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般临床指标及外周血各类T 细胞水平比较

DR 组及NDR 组空腹血糖水平均显著高于NC 组（均P＜0.05）。同时两组HDL-C 均显著低于NC 组（均P＜0.05）。DR 组年龄、TG、LC 及SCr 均显著高于NDR 组及NC 组（均P＜0.05）。DR 组病程、HOMA-IS、HOMA-IR、CP、NLR 及PLR 均显著高于NDR 组（均P＜0.05）。三组间性别卡方检验无统计学差异，HbA1c、LDL、BMI、TC 等非参数检验分析无统计学差异（均P＞0.05，见表1）。

DR 组及NDR 组外周血CD3+T 细胞水平均显著高于NC组（均P＜0.05）。DR 组衰老CD8+T 细胞和衰老CD3+CD8+ T细胞水平均显著高于NDR 组及NC 组（均P＜0.05）。但两组间衰老CD4+T 细胞和衰老CD3+CD4+T 细胞水平非参数检验均无统计学差异（见表2）。CD3+CD8+T 细胞水平三组间比较，差异无统计学意义。（见表2）

2.2 Spearman 相关分析

外周血CD8+衰老T 细胞与DR、HOMA2-IR、FPG、FCP呈正相关(r=0.325、0.286、0.246、0.228，均P＜0.05)，与胰岛素敏感指数（HOMA2-ISI）呈负相关（r=-0.264，P＜0.05，表3 ）。

2.3 Logistic 回归分析

为排除混杂因素影响，将具有统计学意义的变量引入非条件多因素Logistic 回归分析模型，以有无DR 为因变量，以SCr、HOMA2-β、NLR、PLR、FPG、BMI、LDL-C、HDL-C 等指标为自变量，把性别、年龄和病程三个作为协变量进入模型，调整上述三个变量，一定程度上校正了不均衡性。结果显示TG、HOMA2-IR、PLR 和衰老CD8+T 细胞是DR 的独立危险因素（OR=2.080、2.297、1.030、1.074，均P＜0.05，表4）。

3 讨论

DR 是糖尿病患者一种严重的微血管眼底病变，是导致糖尿病患者失明的首要原因。大多患者视力损害呈渐进性加重，引起视觉损伤时才引起重视，从而错失了治疗的最佳时机，导致不可逆性失明，严重影响生存质量[7]。因此，早期识别 DR的危险因素，及时干预病情进展，对改善临床症状意义重大。

目前研究发现衰老CD8+T 细胞介导的炎症反应参与了一些慢性低度炎症疾病的病理生理过程[4]。糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，其特征是胰岛素抵抗引起的葡萄糖稳态受损，并伴有慢性低度全身炎症[8]。动物实验[5]及人体研究[9]结果均表明，外周血中衰老的CD8+T 细胞频率增加与2 型糖尿病的患病率和独立相关，其原因可能是：（1）糖尿病患者衰老T 细胞通过高表达促炎细胞因子和细胞毒分子介导全身炎症反应，参与糖尿病的发生发展；（2）衰老T 细胞损伤肝脏的胰岛素敏感性，使糖调节受损。本研究结果显示，T2DM 患者外周血衰老CD8+T 细胞频率较正常对照组明显增加，并且衰老CD8+T 细胞与FPG、HOMA2-IR 呈正相关，与HOMA2-ISI 呈正相关，这与上述研究结果相似。

DR 是糖尿病微血管并发症在视网膜血管的表现，主要危险因素包括糖尿病病程延长、血糖控制不佳、血脂异常、IR、炎症反应、PLR 等[10]。IR 是指机体对胰岛素介导的葡萄糖摄取和利用能力下降，表现为靶组织细胞对胰岛素的不敏感，是T2DM 发病的重要机制。临床研究发现IR 是 T2DM 患者发生 DR 的一项独立危险因素[1]。本研究显示衰老CD8+T 细胞水平升高是DR 的危险因素，衰老CD8+T 细胞可能参与了DR的发生和进展，但其确切机制尚不清楚，可能主要包括：（1）IR 是DR 发病的危险因素，既往研究表明[11]，促炎细胞因子可以促进胰岛素抵抗，衰老CD8+T 细胞通过分泌更多的炎性因子和细胞毒性分子，损害肝脏胰岛素敏感性，促进胰岛素抵抗，从而加重DR 的损伤；（2）有研究发现[12]，DR 患者的氧化应激水平高于无DR 糖尿病患者和正常对照组。提示氧化应激是DR 进展的重要危险因子。衰老CD8+T 细胞存在着线粒体功能障碍，特征是线粒体含量减少，剩余的线粒体积增大伴功能失调，从而导致活性氧(ROS)生成增加，进一步激活视网膜内皮细胞中的内质网应激，促进细胞凋亡，加重IR；（3）有学者指出[13]肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）参与DR 的发生和进展，血清TNF-α 水平升高与DR 的严重程度呈正相关，衰老CD8+T 细胞可分泌高水平的TNF-α，破坏血-视网膜屏障，导致视网膜血管通透性增高，刺激血管外基质过量产生和血管内皮细胞的增殖，导致眼内新生血管形成，促进DR 进展；（4）长期血糖控制不佳是 DR发病的基础和危险因素，衰老CD8+T 细胞可能参与糖尿病发展过程中的炎症反应，引起糖稳态失衡[14]。（5）有学者指出[15]PLR 是一种与DR 的发生密切相关的新型炎症指标，代表感染和免疫信号，而DR 患者体内衰老T 细胞的增加可引起T细胞功能障碍[16]，对免疫功能产生负面影响并加重感染，从而导致了DR 患病率的升高。上述研究证实 IR、炎症反应和慢性高血糖共同参与了DR 的发生和进展，而衰老CD8+T 细胞可以加重IR、全身炎症反应和慢性高血糖，因此这可能是其加重DR 的发生发展的机制。本研究结果显示衰老CD8+T 细胞与 HOMA-IR、FPG 呈正相关，Logistic 回归分析结果显示，病程、HOMA-IR、PLR 和衰老CD8+T 细胞是DR 发病的独立危险因素，均与上述研究结果符合。

综上所述，T2DM 患者外周血衰老CD8+T 细胞水平明显升高，合并DR 者更高，衰老CD8+T 细胞水平升高可能与DR的发生相关。考虑到T2DM 相关并发症很难仅通过血糖控制来治疗，以衰老细胞为靶点可能是更有效的治疗选择。因此我们需要更大规模的前瞻性研究和复杂的机制实验来确认免疫衰老的调节是否是DR 潜在的新治疗靶点。

表1 各组一般临床及生化指标比较

表2 各组外周血T 细胞频率比较

表3 CD8+衰老T 细胞和临床各指标的相关性分析(r)

表4 二元Logistic 回归分析DR 的危险因素