UHPLC-MS/MS 法检测中成药及保健食品中非法添加文拉法辛的研究

王超众 王萌萌 刘信奎 张连成 于百青 杨敏 孙伟 初红涛

抑郁症是精神类疾病的一种,抑郁症患者主要表现出心境障碍、情绪低落、思维迟缓,病情严重时还会合并厌世、自残等消极行为,患者自身安全也受到威胁［1-6］。文拉法辛是一线抗抑郁药之一,也是第一个去甲肾上腺素、5-羟色胺再摄取双重抑制剂类抗抑郁药物,可用于治疗各型抑郁症［7-10］。近年,有非法商家向所谓抗抑郁症类“纯中药”及“保健食品”中非法添加文拉法辛的现象,由于在处方中未标明含有文拉法辛药物成分,因此容易令患者忽视并大量长期服用,存在较大的安全隐患,有必要建立方法并对这些样品进行检验［11］。为整顿市场乱象、打击不法份子,本文建立测定非法添加文拉法辛的超高效液相色谱-串联质谱法,该方法简便、准确、灵敏度高,可为中成药及保健食品中非法添加文拉法辛检测提供技术依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Thermo Vanquish H 型高效液相色谱仪,Xcalibur 3.0.63 工作站(美国Thermo 公司)；Thermo TSQ Quantum Access 型质谱仪,Chromeleon 7.2.10 工作站(美国Thermo 公司)；Sartorius BP211D 型电子天平(德国Sartorius 公司)；Rotina 380R 型高速冷冻离心机(美国Hettich 公司)；KQ-500VDV 型台式三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,功率为500 W,频率为45 kHz)。

1.2 试药 盐酸文拉法辛对照品(中国食品药品检定研究院,批号100543-202003,含量100.0%)；实测样品来自于市场抽检；乙腈、甲酸和乙酸铵均为色谱纯,购自美国Fisher 试剂公司；水为超纯水,其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ACES C18(150 mm×2.1 mm 1.7 μm)色谱柱；流动相：0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸铵(A),乙腈(B),梯度洗脱(0～2 min 时90%A,2～2.1 min时65%A,2.1～4 min 时65%A,4～4.1 min 时60%A,4.1～6.5 min 时60%A,6.5～7 min 时20%A,7～9 min 时20%A,9～9.1 min 时10%A,9.1～15 min 时10%A)；流 速：0.3 ml/min；进样量：2 μl；柱温：40℃。

2.1.2 质谱条件 电离方式：电喷雾正离子模式(ESI+)；检测方式：选择反应监测(SRM)；雾化气：N2；鞘气流速：30 bar；辅助气流速：10 bar；源电压：4000V(+)、3500V(-)；毛细管温度：270℃；定性离子对、定量离子、碰撞能量和离子化模式。见表1。

表1 文拉法辛的主要质谱参数

2.2 溶液配制 对照品溶液：取盐酸文拉法辛对照品适量,精密称定,用甲醇超声处理,制成含文拉法辛浓度为100 μg/ml 的对照品贮备液溶液。精密量取上述溶液,用初始流动相稀释成浓度为500 ng/ml 的对照品溶液。供试品溶液：精密称取样品1 g,置50 ml 量瓶中,加甲醇适量,超声提取15 min,放冷至室温,用甲醇定容至刻度(若样品中含有油脂,则将样品提取液在-20℃条件下放置24～48 h,时间可视样品是否澄清而定),5000 r/min 离心5 min,上清液经微孔滤膜过滤(0.22 µm),取续滤液作为供试品溶液。

空白溶液：除不加样品外,配制过程与供试品溶液相同。取上述3 种溶液,按照“2.1”项下的色谱-质谱条件进样分析,记录反应监测(SRM)色谱图。见图1。

图1 A 对照品溶液 B 供试品溶液 C 空白溶液的SRM 色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察精密量取对照品贮备溶液适量,用初试流动相稀释成浓度为50、100、200、500、1000、1500、2000 ng/ml 的对照品系列溶液,按照“2.1”项下的色谱-质谱条件进样分析,记录SRM 色谱图,以浓度(X,ng/ml)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,曲线方程为Y=4.336X+0.2561,r=0.9998,结果见表2,由结果可知,文拉法辛在50～2000 ng/ml 的浓度范围内呈良好的线性关系。

表2 文拉法辛回归方程、相关系数、检测限、定量限结果

2.3.2 检测限和定量限考察 将“2.3.1”项下的最低浓度溶液用初始流动相继续稀释,进样2 μl,记录SRM色谱图,以信噪比(S/N)=3 为指标确定检测限,以信噪比(S/N)=10 为指标确定定量限,结果见表2,可见方法的灵敏度完全能够满足非法添加化学药物的检测要求。

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液,按照“2.1”项下的色谱-质谱条件,连续进样6 次,记录SRM 色谱图,计算文拉法辛的定量离子对质谱峰面积的RSD,结果为0.85%,说明该方法的精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取阴性样品,加入适量对照品储备液,混匀,按“2.2”项下供试品的制备方法制备并测定,重复操作6 次,计算文拉法辛含量的RSD 值为1.59%,表明该方法重复性较好。

2.3.5 稳定性试验 取“2.3.4”项下供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、10、12 后进样分析,记录定量离子对SRM 色谱图,计算文拉法辛峰面积RSD 值,结果为2.86%,表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.3.6 加样回收试验 精密称取阴性样品1 g,分别置6 个50 ml 量瓶中,分别精密加入对照品储备溶液0.25 ml,加甲醇适量,超声提取15 min,放冷至室温,用甲醇定容至刻度(若样品中含有油脂,则将样品提取液在-20℃条件下放置24～48 h,时间可视样品是否澄清而定),5000 r/min 离心5 min,上清液经微孔滤膜过滤(0.22 µm),取续滤液进样分析,文拉法辛的回收率及RSD 值结果见表3,由结果可看出该方法测量准确度良好。

表3 加样回收试验结果(n=6)

2.3.7 样品测定 从市场收集声称有抗抑郁作用的中成药及保健食品样品共10 批,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,外标法计算非法添加药品含量,经测定,10 批样品中均未检出非法添加文拉法辛化学成分。

3 讨论

3.1 色谱条件优化 液相色谱-串联质谱联用仪中,流动相通常使用乙腈作为有机相,为了增加离子化效率通常在流动相中添加一定浓度的甲酸、甲酸铵或乙酸铵等。本试验考察了乙腈和0.1%甲酸、20 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸、10 mol/L 甲酸铵溶液和 10 mmol/L乙酸铵溶液、0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸铵溶液等。结果采用乙腈和0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸铵溶液作为正模式流动相,文拉法辛灵敏度更高,故采用为本文方法。

3.2 质谱条件优化 取浓度为500 ng/ml 的文拉法辛对照品溶液用于质谱条件优化。本实验采用ESI 进行离子化,分别用正离子模式和负离子模式进行全扫描,结果均在 ESI+模式下文拉法辛响应更好,故本方法采用正离子模式进行检测。在ESI+模式下进行母离子扫描,扫描范围为m/z 100～500,得到［M+H］+峰［278.2］+,并适当调节相应的毛细管电压,使得母离子一级扫描时相应最高。确定母离子及其毛细管电压,继续进行子离子扫描,以得到最佳的二级质谱条件,最终将优化后得到的定量定性离子对、碰撞能量作为文拉法辛的SRM 扫描参数。