不同培养基对玫烟色棒束孢菌株的复壮研究

郭恒 赵义涛 郑海霞 张仙红

关键词玫烟色棒束孢;复壮;毒力;产孢量

虫生真菌是一类重要的昆虫病原微生物，但经多次继代培养后，常常会发生菌落颜色、生长形式等的变化，特别是产孢能力下降甚至丧失，进而导致虫生真菌的毒力大幅度降低，这种表型退化、表型不稳定、表型恶化、双重表型、突变和衰变均可称为菌株退化。虫生真菌退化的原因多种多样，据樊美珍报道，菌株本身遗传物质改变及培养基成分和环境条件的影响可导致菌株退化;李琳等通过比较转录组学研究发现，绿僵菌中一些参与胁迫响应和衰老的相关基因在退化菌株中显著上调，推测退化菌株表现为老化现象，发现活性氧（ROS）引起的线粒体损伤是导致菌株退化的机制之一;此外，转座子随机插入，真菌双链RNA病毒的入侵或者染色体的缺失等均可导致菌种退化。但这些原因都不能很好地解释真菌退化的频率远远超过这些事件发生的概率，且不同菌株退化频率也不尽相同，因此人们尝试通过多种方法恢复菌种原有性状。

虫生真菌频繁发生的菌种退化，成为其大规模生产应用所面临的重要问题，也为菌种保藏工作带来很大的困难。研究表明，虫生真菌可采用虫尸接种、宿主感染、培养基分离、培养基添加外源营养物质等方法复壮。如邹东霞等采用马尾松毛虫Dendrolimus punctatus Walker虫尸对球孢白僵菌Beauveria bassiana（Bals.-Criv.）Vuill.BD-10-4菌株进行了复壮;马元伟等通过培养基中添加外源氨基酸对罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii J.F.Bisch.S.A.Rehner&Humber ARSEF2575菌株进行了复壮，并有效延缓了蛹虫草Cordycepsmilitaris Link 01菌株的退化;Bult等研究发现经过大蜡螟Galleria mellonella Linnaeus和黄粉虫Tenebrio molitor Linnaeus 2种易感菌寄主回接的金龟子绿僵菌M.anisopliae（Metschn.）Sorokin菌株毒力比人工培养基上培养的显著增强;李亚洁等[6]采取组织分离、孢子分离对蛹虫草进行了复壮等。

玫烟色棒束孢Wize属虫草菌科棒束孢属，可寄生8目40多种昆虫，尤其对蚜虫、粉虱等刺吸式口器害虫有很强的致病力，所以在害虫生物防治中有着非常重要的作用。目前，国内外对玫烟色棒束孢的研究报道主要集中在生物学、分类鉴定、致病力测定、致病机理、防治应用等方面，对菌株的复壮或预防菌株退化方面的研究鲜有报道。为此，本试验采用培养基添加外源营养物质的方法对玫烟色棒束孢退化菌株进行复壮，旨在探寻简便而有效的复壮方法，为玫烟色棒束孢的规模化生产和开发利用提供生产用菌株。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

玫烟色棒束孢菌株PF904为山西农业大学农学院农业害虫防治研究室经多次转接后退化的菌株。

1.1.2供试培养基

本试验所用培养基及配方见表1。

1.2方法

1.2.1菌株复壮

将供试菌株分别接种于上述5种培养基上，培养7d后转接至相同的新培养基上，共转接10代。每代每种均重复3次，测定数据取平均值。

1.2.2菌株生长量测定

使用电子游标卡尺在培养皿上以十字交叉法，对不同培养基上的菌落直径进行测量，每代培养至14 d时记录数据。

1.2.3菌株产孢量测定

将培养好的菌株，利用直径为7mm的打孔器在固体平板培养基上菌落的中央至边缘1/2处打孔取样，放人有10 mL 0.05%吐温-80无菌水中，使用涡旋振荡仪将孢子充分洗脱混匀，然后用灭菌纱布过滤。利用血球计数板计数测量，换算成单位面积的孢子产量。每种培养基各取3个平板作为重复。

1.2.4室内毒力测定

将培养好的菌落，用10mL 0.05%吐温-80无菌水洗脱适量孢子，分别制成孢子含量为107个/mL的孢子悬浮液，采用浸虫法进行室内毒力测定。选取生长一致的小菜蛾3龄幼虫，浸入孢子悬浮液中10s后取出，用滤纸吸去虫体上多余的菌液，然后放入有甘蓝叶片的9cm无菌培养皿中，每皿20头，保持皿内湿度。各试验处理重复3次，并用0.05%的吐温-80溶液作为对照处理。连续观察7d，记录死亡虫数，并将死亡的虫体挑出，保湿培养，死亡虫体变僵硬并长出菌丝视为有效感染死亡，并计算校正死亡率。

校正死亡率=（处理死亡率一对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100%。

1.2.5恢复比例测定

试验过程中对菌株产孢量以及毒力两项指标的恢复情况进行比较，并取测定数据的平均值分别计算得出相应恢复比例。试验共复壮培养10代，每培养5代测定一次，分别在第5代和第10代测量2次。

复壮培养至第5代时产孢量及毒力恢复比例：

恢复比例第5代菌株测定值一初始菌株测定值/初始菌株测定值。

复壮培养至第10代时产孢量及毒力恢复比例：

恢复比例第10代菌株测定值一第5代菌株测定值第5代菌株测定值。

1.2.6数据处理

试验数据均使用IBM SPSS Statistics 20.0软件和Excel 2010软件进行分析处理。

2结果与分析

2.1玫烟色棒束孢菌落形态的变异

随着传代次数的增多，PDA上培养的玫烟色棒束孢菌落浓密的同心圆纹逐渐消失，有的菌落产生扇形条纹，且伴有菌落质地变疏松、稀薄，孢子层变薄的现象，菌落颜色逐渐失去原有的浅粉色而變为白色，菌落形态也由绒毛状变为絮状。但在复壮培养基上这些现象只在前5代偶有发生，且气生菌丝生长较PDA培养基少，说明添加营养物质的复壮培养基对于延缓和预防菌株退化变异具有一定的作用。

2.2不同培养基对玫烟色棒束孢菌落生长的效果

通过对培养14d后的玫烟色棒束孢菌落直径的对比发现，甲壳素培养基上的菌落生长速率较快且稳定，从第4代开始与对照PDA培养基具有显著性差异，从第6代开始与其前4代具有显著性差异，培养至10代时菌落直径最大，达69.33mm，各代平均为65.39mm。其次是蚕蛹培养基，从第4代开始与其第2代具有显著性差异，但之后6代生长速率变慢，各代平均为63.18mm。综合培养基上的生长速率也较为稳定，但复壮过程中，每2代之问直径变化幅度较小，14d时菌落直径为59.22～64.45mm，平均为61.55mm，波动较小。蝉蜕培养基上菌落的生长速率代际间不稳定，在复壮过程中生长时快时慢，直径范围在60.38～66.51mm之间（表2）。总体上每种培养基上的菌落直径均随传代次数的增加而逐渐增加，菌丝生长量也增大，其中甲壳素培养基对菌落生长具有明显的促进作用，具体原因还需进一步研究。

2.3玫烟色棒束孢在不同培养基上的产孢量

4种不同培养基复壮后玫烟色棒束孢的产孢量如图1所示。从第2代开始经4种培养基复壮后的菌株，产孢量与初始菌株具有显著性差异。经蚕蛹培养基复壮的菌株，产孢量恢复效果最好，在复壮培养过程中产孢量一直处于最高水平，从第8代开始与其他3种培养基产孢量均具有显著性差异，连续复壮10代后，菌株产孢量可达1.73×10个/cm2，提升3倍之多。综合培养基上的产孢量仅次于蚕蛹培养基，始终与甲壳素培养基和蝉蜕培养基的产孢量具有显著性差异，连续复壮培养10代后，综合培养基产孢量为1.58×10个/cm2。甲壳素培养基复壮的效果次之，单位面积产孢量为1.33×10个/cm2。效果较差的是蝉蜕培养基，复壮10代后与其他3种培养基均具有显著性差异，产孢量仅为初始菌株的2.6倍。

2.4玫烟色棒束孢在不同培养基上的毒力

复壮后的玫烟色棒束孢菌株对小菜蛾幼虫的致死中时（LT50）和校正死亡率如表3所示。小菜蛾幼虫接种不同培养基复壮的菌株后，第3天幼虫出现死亡，对照也有个别幼虫死亡，第4天开始有僵虫出现，死亡率随着接种时问逐日递增，各菌株侵染7d后，大部分幼虫死亡，个别结茧化蛹。

如表3所示，4种复壮培养基均表现出明显的复壮效果，致死中时（LT50）均显著小于初始菌株，其中，甲壳素培养基复壮的菌株毒力恢复效果最好，连续复壮10代后，菌株对小菜蛾的致死中时由初始菌株的5.86 d下降为3.32d，与其他3种培养基均具有显著性差异，校正死亡率也具有显著性差异，在第7天的累积校正死亡率达82%以上;其次是综合培养基复壮，LT50第10代下降为3.53 d，在处理后第7天累积校正死亡率也达76%以上;蝉蜕培养基毒力恢复效果次之;效果最差的是蚕蛹培养基，复壮菌株对小菜蛾幼虫的LT50和校正死亡率与其他3种培养基复壮的菌株相比均具有显著性差异，且复壮10代后，第7天的累积校正死亡率仅为68.26%。

2.5玫烟色棒束孢在不同培养基上产孢量及毒力恢复比例

比较菌株经4种培养基复壮10代后，菌株产孢量和毒力（致死中时LT50）的恢复比例如表4所示。玫烟色棒束孢菌株在经过不同培养基复壮后，菌株的产孢量和毒力均有大幅提高，总体趋势呈现复壮1～5代恢复比例较高，5～10代恢复比例有所下降。经10代复壮，甲壳素培养基恢复比例较为稳定，下降速率比其他3种培养基低，恢复效果较稳定。而蚕蛹培养基两项指标的恢复比例均在培养过程中下降幅度较大。

在产孢量方面，初始菌株经过蚕蛹培养基5代复壮后，恢复比例可达126.8%，之后5代的恢复比例下降为87.4%，但与其他复壮培养基恢复比例相比均为最高值。在毒力方面，初始菌株经过甲壳素培养基5代复壮后，恢复比例为25.77%，之后5代复壮恢复比例仅下降为23.68%，与其他复壮培养基恢复比例相比也均为最高值。

3结论与讨论

3.1产孢量

虫生真菌菌株的产孢量是衡量菌株活力的重要指标之一。菌株具有较高的产孢量和高质量的孢子是其可以应用于大规模生产的必备条件。据报道，培养基是影响微生物生长和繁殖的重要因素之一，即营养对菌株生长和产孢有很大影响，若不能满足菌落生长的营养条件，许多菌株就不能生长或产孢。浦静等研究发现，培养基中以麦芽糖为碳源可能更利于玫烟色棒束孢菌株产孢;此外培养基中添加适量的动物性氮源也有助于菌株产孢。本试验结果表明，添加含氮量较高的动物性氮源蚕蛹粉的培养基使供试菌株的产孢量恢复最好，其次是综合培养基和甲壳素培养基复壮，蝉蜕培养基复壮效果最差。这可能和培养基中动物性氮源含量有关，具体原因有待进一步探索。

3.2毒力

虫生真菌菌株的毒力是衡量菌株应用潜力的重要指标。蔡国贵等研究发现，菌株在营养丰富的培养基中生长相对稳定，在营养贫瘠的培养基中生长则容易变异，不同培养基通过影响菌株酶的表达水平引起菌株毒力的变化;李会平等研究发现，白僵菌菌株产酶能力与其对桑天牛幼虫的毒力呈正相关关系，培养基成分和培养条件会影响菌株的产酶能力，进而影响菌株毒力。甲壳素粉中蕴含的磷脂与蛋黄素可促进分生孢子的萌发和有效侵染，且稳定甚至增强菌株毒性。本结果发现，供试菌株经甲壳素培养基复壮后对小菜蛾幼虫毒力恢复效果最好，这可能是因为玫烟色棒束孢菌株在吸收其营养后，能较好地诱导菌株产生几丁质酶，并增强了该酶的活性有关。

3.3恢复比例

分析试验结果发现，在多次复壮的过程中，4种培养基均表现出了随着复壮代数的增加产孢量和毒力的恢复效果逐渐减弱的现象，但是甲壳素培养基具有相对较好的稳定性，恢复效果的下降速率较慢，原因可能是几丁质是真菌细胞壁的主要组成成分，对菌株的生长发育必不可少，同时也提高了菌株体内几丁质酶的活力。其次是综合培养基恢复效果较好，可能是综合培养基具有更多种营养物质，形成了稳定的组合，能让菌株吸收不同性状生长所需要的营养。而蝉蜕培养基在复壮过程中对菌株2个指标的提升比例均不突出。此外添加蚕蛹粉的培养基仅使菌株在产孢量方面有大幅度提高，在毒力方面复壮效果不突出，且恢复比例波动较大，可见其稳定性不足，具体原因还有待进一步探索。

综上所述，动物性氮源对玫烟色棒束孢的产孢有促进作用，所以经蚕蛹培养基复壮获得的菌株产孢量有了明显的提高，但对小菜蛾幼虫的毒力并没有显著的恢复，说明产孢量大的菌株毒力不一定強。甲壳素培养基对玫烟色棒束孢菌株的生长和毒力均有明显的促进作用，但在产孢量方面恢复效果一般，其恢复比例较稳定。因此，在生产中应用玫烟色棒束孢菌株，应根据具体需要综合考虑多种指标的影响选择复壮添加的营养物质。