香茅油对枸杞蚜虫的触杀毒力及乙酰胆碱酯酶和Na+—K+—ATPase活性的影响

陈新华+万炜+冯淑军+段立清

摘 要：研究香茅油（Citronella oil）对枸杞蚜虫（Aphis sp.）的毒力及乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）和Na+-K+-ATPase活性的影响，为寻找无公害防治枸杞蚜虫的方法提供理论依据。采用玻璃管药膜法进行生物测定，评估其对枸杞蚜虫的毒力。测定其对蚜虫离体AChE和Na+-K+-ATPase活性的影响。香茅油的LC50为11.97mL/L，对枸杞蚜虫离体AChE和Na+-K+-ATPase活性均有抑制作用，其中对Na+-K+-ATPase活性表现为低浓度促进，高浓度抑制。香茅油对枸杞蚜虫有触杀毒力，对枸杞蚜虫离体AChE和Na+-K+-ATPase活性均有抑制作用。

关键词：香茅油；毒力；枸杞蚜；乙酰胆碱酯酶；Na+-K+-ATPase

中图分类号：S482 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170833060

枸杞（Lycium barbarum L.）为茄科多年生落叶灌木，是著名药用植物和出口产品（张宗山等，2007），又是国家卫生部公布的药食同源品种。枸杞蚜（Aphis sp.）是枸杞的重要害蟲之一，成虫、若虫刺吸危害枸杞嫩叶、花蕾、幼果、生长点，在我国枸杞栽培区发生面积大、危害重，造成枸杞大量减产。且化学农药长期大量的使用，使农药残留日渐加重，严重破坏了枸杞的品质，直接危害人体健康，加大了宁夏枸杞进入国际市场的难度。因此，目前对高效、低毒、低残留、对环境污染小的生物制剂的需求非常迫切，从植物中发现农药活性物质，开发新型无公害农药是新农药创制的重要途径。植物精油对昆虫具有熏蒸、触杀、驱避、抑制生长发育的作用。Enan研究表明，精油主要作用于昆虫的神经系统，AChE和Na+-K+-ATPase均与昆虫的神经系统信号传导有关。关于香茅油的趋避、抑菌、杀虫作用已有报道，故探讨香茅油对枸杞蚜虫的毒力及对AChE及Na+-K+-ATPase的影响，为深入研究香茅油的杀虫机理提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试昆虫

枸杞蚜虫（Aphis sp.）采自内蒙古农业大学温室内栽培的未经任何农药处理的枸杞植株上。

1.2 试剂

香茅油（单方精油），ATPase测试盒（购自南京建成生物工程研究所），丙酮、考马斯亮蓝 G250、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二钠、蔗糖、氯化钠。

1.3 生物测定

将香茅油用丙酮稀释成经预实验所得的不同浓度梯度，丙酮作为对照。用玻璃管药膜法（鲁艳辉等，2009）测定其对枸杞蚜虫的触杀作用。吸取300L药液加入直径1.5cm、高8cm的指形管内，迅速转动，使药液均匀涂布与指形管内，待丙酮挥发后接入待测蚜虫进行毒力测定。每管接入大小一致的无翅成蚜30头，室温下4h、12h后开始观察记录死亡虫数。每个浓度设3个重复。死亡标准以毛笔拨动虫体，不动者记为死亡。

1.4 酶液的制备及酶活性的测定

1.4.1 AChE酶液的制备及酶活性的测定

枸杞蚜虫AChE酶液制备参见高希武的方法，将200头未经任何处理的健康蚜虫置于玻璃匀浆器中，加入预冷的0.1mol/L pH值为7.6的磷酸缓冲液，冰预匀浆，匀浆液于12000rmp 4℃下离心15min，取上清液作为酶源，低温保存待用。

取待测酶液0.1mL酶液与0.1mLASCh混合，30℃水浴保温15min后，加入DTNB显色剂显色并终止反应，于412nm下测定OD值。用丙酮将供试药剂稀释成所需浓度，向酶促反应阶段的反应体系中加入酶液和药剂，其他步骤同AChE酶活力测定。按下面的公式计算抑制率：

酶的抑制率（%）= ×100%

1.4.2 Na+-K+-ATPase酶液的制备及酶活性的测定

枸杞蚜虫 Na+-K+-ATPase酶液制备参见Feng等的方法，并有改进。将200头未经任何处理的健康蚜虫置于玻璃匀浆器中，加2mLTris-HCl缓冲液，冰浴下匀浆。匀浆液于4℃，3000g下离心10 min，取上清液于10000g离心30 min，弃去上清液，沉淀用上述缓冲液溶解后作为酶源。按ATPase测试盒（南京建成生物工程研究所）说明测ATPase活性定。ATPase活力单位为μmolPi/mg prot/hour，试验重复3次。

用丙酮将供试药剂稀释成所需浓度，向酶促反应阶段的反应体系中加入酶液和药剂，测定药剂对枸杞蚜 Na+-K+-ATPase活性的影响，计算抑制率。

ATPase活力=×标准品浓度×6×7.8÷待测样本蛋白浓度

注：标准品浓度0.02μmol/ml； 6：定义上为每小时，实际操作10min反应，所以必须乘以6；7.8：反应体系中7.8倍稀释。

1.5 酶液中蛋白质含量测定

参照Bradford的考马斯亮蓝G-250法。

1.6 数据处理

测定数据采用EXCEL和POLO软件进行分析处理，计算致死中浓度（LC50）值以及抑制率。

2 结果与分析

2.1 香茅油对枸杞蚜虫的触杀毒力

LC50值是用来衡量药剂室内毒力效果大小的指标，LC50越小，表明毒力效果越好，处理4h、12h香茅油对枸杞蚜虫的LC50分别为11.97（9.86～16.40）mL/L和3.35（2.53～4.04）mL/L（表1），说明香茅油对枸杞蚜虫具有触杀毒力。香茅油不同浓度对枸杞蚜虫死亡率的影响见图1，浓度与死亡率成正比例关系，即死亡率随着浓度的增大而增大。浓度为10mL/L条件下，处理4h、12h的死亡率分别为48.45%和95.56%。

2.2 香茅油对AChE活性的影响endprint

在离体条件下，香茅油对枸杞蚜虫AChE活力的影响见表2，可以看出，对照枸杞蚜虫AChE活力最高，为1.44±0.01mmol/min·mgpro；香茅油浓度为10mL/L时，枸杞蚜虫AChE活力最低。香茅油各浓度处理的枸杞蚜虫AChE活力均与对照存在显著差异（P<0.05）。精油浓度与抑制率呈剂量-效应关系，即随着精油浓度的增加，对蚜虫AChE抑制率增加。以对照的比活力值为1，香茅油浓度在2、4、6、8、10mL/L时，对应的比活力比值分别为0.84、0.75、0.71、0.60、0.55。

2.3 香茅油对Na+-K+-ATPase活性的影响

香茅油浓度为2ml/L时，对枸杞蚜虫Na+-K+-ATPase的抑制率为负值，说明香茅油浓度为2ml/L时对枸杞蚜虫离体Na+-K+-ATPase活性表现为激活作用，香茅油浓度为4、6、8、10ml/L对枸杞蚜虫Na+-K+-ATPase有抑制作用，且抑制作用随着浓度的升高而增大。

3 结论与讨论

香茅油对枸杞蚜虫具有触杀毒力，且死亡率随着浓度的增大而增大，处理12h的死亡率达到95.56%。香茅油对枸杞蚜虫AChE活性具有显著抑制作用，且浓度与抑制率呈正相关。香茅油对枸杞蚜虫Na+-K+-ATPase活性影响表现为低浓度促进高浓度抑制。

万树青等研究发现11个多炔类化合物对美洲大蠊（Periplaneta americana）离体AChE活性抑制有抑制作用（万树青，2005），AChE 是有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标。Na+-K+-ATPase对胞内外的Na+、K+具有主动运输的功能，是拟除虫菊酯类杀虫剂的靶标位点之一，当Na+-K+-ATPase活性被抑制，昆虫的神经系统功能出现紊乱，最终使昆虫致死。本实验研究结果表明，香茅油对枸杞蚜虫AChE和Na+-K+-ATPase均表现出了抑制作用，由此可以推断，香茅油作为一种神经毒剂作用于枸杞蚜虫，影响昆虫神经系统正常的信号传导，最终导致昆虫死亡。本实验为香茅油的杀虫效果及机理，为香茅油的进一步开发利用提供了理论依据。

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作者简介： 陈新华（1989-），女，内蒙古赤峰人，研究方向：农业昆虫与害虫防治。endprint