全胚冷冻技术对活产率和卵巢过度刺激综合征发生的影响

王春利,施文浩,徐 洁

(西北妇女儿童医院生殖中心,西安 710003)

冻融胚胎移植的首例“试管婴儿”于1984年在澳大利亚的成功出生，是辅助生殖技术的又一里程碑事件[1]。至今，胚胎冷冻技术已经成功应用在临床30多年，它能减少患者促排卵和取卵的次数，减少胚胎的浪费，大大降低患者的痛苦，提高累积妊娠率[2]。同时，胚胎玻璃化冷冻技术的应用可有效解决胚胎解冻后存活率的情况，避免排卵周期中刺激素对于子宫内膜的影响，预防妊娠过程中可能出现的卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)[1]。因此，全胚冷冻辅助生殖技术已经逐渐作为常规方案应用于临床[3]。近年来关于全胚冷冻技术的临床研究较多，但关于取卵数较多的相关研究较少，同时玻璃化冷冻技术在我国应用时间不长，其安全性尚存在争议[4]。因此，本研究采取回顾性分析方式，分析首次完整周期且取卵数大于或等于15个的患者资料，探究全胚冷冻技术对首次取卵数大于或等于15个患者的累积活产率(cumulative live birth rates，CLBR)和OHSS发生的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2017年12月在本院行体外受精-胚胎移植且取卵数大于或等于15个的2 983例女性患者为研究对象，平均年龄(30.67±3.93)岁。本研究经本院伦理委员会审核批准，患者及家属签署知情同意书。纳入标准：(1)首次取卵数大于或等于15个；(2)存在男方因素、女方排卵因素、女方输卵管因素、混合因素、不明原因等不孕因素；(3)年龄20～50岁。排除标准：(1)生殖器畸形；(2)未移植完所有胚胎而终止治疗；(3)未移植完所有胚胎而进入下一取卵周期；(4)病例和随访资料不全。根据患者接受的胚胎移植方式分为研究组(术前经个体化评估存在OHSS风险，取卵后行全胚冷冻，择期复苏后移植的患者1 036例)和对照组(取卵后新鲜胚胎周期移植的患者1 947例)。

1.2 方法

1.2.1促排卵方案

所有患者均采用短效长方案，当满足卵泡发育成熟时停用卵泡刺激素，抽血检查患者血清孕酮、黄体生成素和雌二醇水平[5]。当晚注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)诱导卵泡成熟，等待36～38 h后行取卵术。

1.2.2胚胎培养与移植

胚胎放入恒温培养箱，温度设定为37 ℃。培养3 d后，取卵观察胚胎卵裂期情况，对照组选择2枚胚胎移植，研究组所有胚胎采用玻璃化冷冻，待患者OHSS风险转化结合子宫内膜准备情况，选取移植时机。冷冻胚胎移植前要进行胚胎复苏，成功复苏冷冻胚胎的标准为单个胚胎中至少存在一半以上的卵裂球[6]，见图1。

A：胚胎卵裂期玻璃化冷冻前；B：胚胎卵裂期玻璃化冷冻后；C：胚囊玻璃化冷冻前；D：胚囊玻璃化冷冻后。

1.2.3子宫内膜准备

(1)自然周期方案：患者正常排卵且平时月经周期规律者采用此方案，月经来潮后第10天B超监测卵泡发育情况，发现排卵后，及时检查患者孕酮水平，冷冻胚胎的移植时机根据孕酮水平决定，每次移植胚胎2枚。当孕酮大于或等于1.5 ng/mL时，于排卵2 d后行卵裂期胚胎移植；当孕酮小于1.5 ng/mL时，于排卵3 d后行卵裂期胚胎移植。(2)人工周期方案：患者自然周期无优势卵泡发育或平时月经周期不规律者采用此方案。于月经来潮第5天，戊酸雌二醇4 mg/d起始，第8天开始根据子宫内膜生长情况补药。当子宫内膜厚度超过8 mm时肌内注射黄体酮60 mg/d，3 d后移植卵裂期胚胎或者5 d后移植囊胚，每次移植胚胎2枚。

1.2.4黄体支持

所有患者取卵后当日开始注射黄体酮针，60 mg/d肌内注射，同时每晚给予地屈孕酮，20 mg/d口服用药。

1.2.5术后随访调查

所有患者皆进行为期2年的随访。行胚胎移植术14 d后查血HCG，囊胚移植术后12 d查血HCG，判断是否妊娠。HCG阳性患者于术后1个月行B超检查，以原始心管搏动及宫内孕囊的出现作为临床妊娠的标准。临床妊娠确定后，行黄体支持至妊娠10周。随访终点为患者首次活产或所有胚胎移植完仍无活产。

1.2.6观察指标

本次研究的主要观察指标为OHSS发生率和CLBR。CLBR为移植完1个周期所得的胚胎获得活产的总概率，采用保守CLBR的计算方法：假设未成功获得活产而选择终止治疗的患者，再无活产机会。同时记录所有患者临床一般指标，包括年龄、身高、体重、不孕因素、基础卵泡刺激素水平、促性腺激素(gonadotropins，Gn)使用时间和剂量、获卵数。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组患者基线资料比较

两组患者不孕因素和Gn使用时间差异无统计学意义(P>0.05)，而年龄、基础卵泡刺激素水平、BMI、Gn剂量和获卵数差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。考虑到年龄因素对基线资料的影响，对两组患者采取1∶1倾向性评分匹配，匹配后研究组和对照组患者数皆为516例，共1 976个周期。匹配完成后，两组患者的年龄、不孕因素、基础卵泡刺激素水平、BMI、Gn使用时间和剂量比较差异无统计学意义(P>0.05)，研究组获卵数多于对照组(P<0.05)，见表2。

表1 两组患者的基线资料比较(倾向性评分匹配前)

组别n基础卵泡刺激素(x±s,U/L)BMI(x±s,kg/m2)Gn使用时间(x±s,d)Gn剂量(x±s,U)获卵数(x±s,个)研究组1 0365.74±1.1521.04±2.5111.25±2.581 664.76±532.4222.43±4.25对照组1 9476.25±1.5821.66±2.7311.14±2.531 839.46±563.6317.43±2.53t/χ23.974 2.457 1.784 3.091 5.452 P<0.001 0.014 0.075 0.002 <0.001

表2 两组患者的基线资料比较(倾向性评分匹配后)

组别n基础卵泡刺激素(x±s,U/L)BMI(x±s,kg/m2)Gn使用时间(x±s,d)Gn剂量(x±s,U)获卵数(x±s,个)研究组5165.83±1.2121.54±2.4111.18±2.261 689.46±542.3921.17±3.34对照组5165.97±1.3821.36±2.5311.21±2.331 749.59±555.7819.58±3.58t/χ21.684 1.004 0.784 1.091 2.382 P0.092 0.315 0.433 0.275 0.017

2.2 两组患者倾向性评分匹配前后OHSS发生率比较

倾向性匹配前研究组有2例发生OHSS，对照组有19例，差异有统计学意义(P=0.015)；倾向性匹配后研究组无OHSS发生，对照组有9例，差异有统计学意义(P=0.007)，见表3。

2.3 两组患者倾向性评分匹配后不同移植周期CLBR比较

5个移植周期中，研究组的CLBR均高于对照组，但只在第1个移植周期差异有统计学意义(P=0.013)，见表4。

表3 两组患者倾向性评分匹配前后OHSS发生率比较(%)

2.4 两组患者倾向性评分匹配后不同获卵数CLBR比较

不同获卵数的研究组CLBR均高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)；研究组的CLBR随着获卵数的增加而增加，对照组在获卵数20～24个时CLBR最高，见表5。

表4 两组患者倾向性评分匹配后不同周期CLBR比较(%)

表5 倾向性评分匹配后两组患者不同获卵数CLBR比较(%)

2.5 研究组患者CLBR的多因素logistic回归分析

多因素logistic回归分析显示，获卵数和年龄是研究组患者CLBR的重要影响因素。在获卵数分组中，20～24个和25个及以上的CLBR各是15～19个的3倍(OR=2.346，95%CI：1.683～3.237)和5倍(OR=5.345,95%CI：4.342～7.182)；在年龄分组中，35～39岁和40～50岁的CLBR各是20～29岁的1/2(OR=0.587,95%CI：0.465～0.718)和1/5(OR=0.247,95%CI：0.175～0.395)。不孕因素、BMI等因素对CLBR无影响(P>0.05)，见表6。

表6 研究组患者CLBR的多因素logistic回归分析

续表6 研究组患者CLBR的多因素logistic回归分析

3 讨 论

OSHH或OSHH倾向作为全胚冷冻技术的重要指征，是进行辅助生殖时常见的并发症，病情会随着妊娠的进展不断恶化。目前研究表明，HCG是其可能的激发因素，但具体机制尚不明确[7]。OSHH具体的临床表现包括胸腹水、肝肾功能损害、血液浓缩、血栓形成[8]等。已有研究表明，导致OSHH的高危因素主要为卵巢功能较好的年轻女性，在促排卵阶段使用较少剂量的促排卵激素便可得到较多的卵泡发育[9]。

本次研究在初始进行基线资料对比时发现，研究组的患者年龄明显低于对照组(P<0.05)，同时其基础卵泡刺激素和Gn剂量也明显低于对照组(P<0.05)，但是获卵数却高于对照组(P<0.05)，与以往研究结果一致[10]。为了消除年龄对于本研究的影响，笔者采用了1∶1倾向性评分匹配的方法，对两组患者数据进行匹配，最终结果显示研究组的OHSS发生率仍明显低于对照组(P<0.05)，表明全胚冷冻技术对首次取卵术大于或等于15个的患者，可以有效预防OSHH的发生，这与MOURAD等[11]荟萃分析的结果一致。临床为了提高辅助成功率而增加取卵数量后，应该选用全胚冷冻技术，从而有效预防OSHH的发生。

本研究结果显示，倾向性评分匹配后研究组的CLBR在5个移植周期均高于对照组，但是只在第1个移植周期差异有统计学意义(P<0.05)。本次研究的患者移植周期均不超过5个，计算全部患者完整周期后，最终结果显示研究组的CLBR高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，说明对于获卵数大于或等于15个的患者，选择新鲜胚胎移植和全胚冷冻对于最终的CLBR无影响，这与以往的研究结果一致[12]。但考虑到首次移植周期内的成功率，全胚冷冻技术要优于新鲜周期移植，因此，仍然建议对首次获卵数较多的患者优先选择全胚冷冻技术。

获卵数增高、CLBR随之增加是CLBR的预测指标之一，已经得到大家的普遍共识，这也与本研究结果一致[10]。同时多项研究结果证实，获卵数增多到一定数量以后，CLBR并不会继续随着获卵数增多而增加。本研究显示，对照组在获卵数大于或等于25个时CLBR并未增加，与以往研究结果一致[9]。VLAISAVLJEVIC等[13]研究表明，在进行新鲜胚胎移植时，卵巢高反应人群的获卵数多，因而可以获得更多的胚胎储存备用，但是随着获卵数的增多OSHH的发生率也随之升高，这与本研究结果一致。因此，在实际临床选择取卵数时，不可盲目增加，而应该根据患者年龄、不孕原因等因素进行分析后选择。

进行全胚冷冻患者CLBR的多因素logistic回归分析后发现，不仅获卵数是CLBR的强预测指标，年龄也是CLBR的重要预测指标。随着年龄的增加CLBR会逐渐下降，年龄分组中，35～39岁和40～50岁CLBR只有20～29岁的1/2和1/5，说明辅助生殖技术可以让大多数不育不孕患者获得活产，但并不能改变和年龄相关的妊娠率下降情况。

目前关于全胚冷冻技术的应用及患者首次取卵数的选择尚没有明确的标准和指南，在实际的临床工作中，需要结合实验室的技术水平和患者的实际情况进行个体化治疗，原则上必须是针对患者全胚冷冻的妊娠结局优于新鲜胚胎移植，或者可以明显降低患者不良妊娠结局发生的可能性[12]。经过分析后认为，可以作为明确的指征包括：OHSS倾向、卵巢高反应、囊胚发育缓慢、卵泡期激素水平较高。同时，本研究作为回顾性研究，研究结果可能存在部分偏倚情况，尚需大样本的多中心前瞻性临床研究和荟萃分析进一步验证。

综上所述，全胚冷冻技术作为一种重要的辅助生殖技术，已经广泛应用于临床实践，但鉴于目前还没有统一的规范和指南，要结合各自生殖中心实验的技术水平，对患者的实际情况进行个体化分析，不可盲目增加取卵数。对于首次获卵数大于或等于15个的患者，如果有OHSS倾向，优先选择全胚冷冻可以有效降低患者发生OHSS的可能，同时有望获得比新鲜周期患者更高的CLBR。