基于RLR信号通路的去泛素化酶对EV71感染的调控机制研究

梁赣锋，沈 扬，俞逊婕，吴海燕

(浙江省台州市第一人民医院感染科 318020)

手足口病是一种由肠道病毒引起的常见传染性疾病，轻度患者临床症状以手、足、口腔等部位出现疱疹为主，重症患者可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑炎等并发症甚至出现死亡[1]。重症病例多由肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)感染引起，病情凶险，病死率高[2]。因此深入研究EV71感染发生的机制对提高临床疗效具有重要的临床指导意义。去泛素化酶是一类数量很大的蛋白酶类家族，可通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白活性[3]。维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-1ike receptor，RLR) 为机体识别病毒的主要免疫识别受体，其介导的信号通路在抵抗病毒感染的过程中发挥着重要作用[4]。有研究显示[5]去泛素化酶对EV71感染有一定调控作用，但其是否通过RLR信号通路发挥调控作用尚不清楚。本研究基于RLR信号通路研究去泛素化酶对EV71感染的调控机制，以期为临床防治EV71感染提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞

人横纹肌肉瘤细胞A-204购于上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.2主要试剂和仪器

10%胎牛血清(上海彩佑实业有限公司)；DMEM培养基(上海达豪生物科技有限公司)；空载质粒(上海柯雷生物科技有限公司)；去泛素化酶USP4过表达质粒(上海权阳生物公司)；总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；反转录试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；RIPA裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)；Thermo MX150离心机(苏州亚凡生物技术有限公司)；BCA试剂盒(美国Thermo公司)；5%脱脂奶粉封闭液(北京百奥莱博科技有限公司)； 兔抗USP4单克隆抗体(上海晅科生物科技有限公司)，兔抗维甲酸诱导基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)单克隆抗体(上海信裕生物科技有限公司)，兔抗黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)单克隆抗体(上海科敏生物科技有限公司)，兔抗LGP-2单克隆抗体(武汉维克赛思科技有限公司)，兔抗GAPDH单克隆抗体(上海强耀生物科技有限公司)，山羊抗小鼠IgG(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；ECL发光试剂盒(上海史瑞克生物科技有限公司)；培养箱(章丘舜泽生物工程有限公司，型号：Thermo BB150)。

1.2 方法

1.2.1实验分组及处理

将细胞分为空白对照组、空载质粒组、去泛素化酶组，进行原代培养，取对数生长期细胞，接种于6孔细胞培养板(5×106个/孔)，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱培养，待细胞融合度达80%，空白对照组不作任何处理，空载质粒组转染10 nmol/L空载质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5)，去泛素化酶组转染10 nmol/L去泛素化酶USP4过表达质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5)，继续培养24 h。

1.2.2RT-PCR检测各组细胞EV71 mRNA表达

采用总RNA提取试剂盒提取其总RNA，反转录试剂盒将其逆转录成cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：上下游引物各10 μmol/L 0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL，总体积20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性120 s;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环。EV71上游引物5′-GAGTGGCAGATGTGATTGA-3′，下游引物5′-TCCAGTGTCTAAGCGATGA-3′。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析，测定各扩增条带吸光度值，以目的基因扩增条带吸光度值与GAPDH扩增条带吸光度值之比计算EV71 mRNA相对表达量。

1.2.3Western blot检测各组细胞USP4、RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达

将细胞加入RIPA裂解液匀浆裂解，13 000 r/min离心15 min，取上清液。BCA试剂盒测定蛋白浓度并定量，取总蛋白上样，电泳，切胶，转膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭，加入1∶400稀释的兔抗USP4单克隆抗体、1∶500稀释的兔抗RIG-Ⅰ单克隆抗体、1∶500稀释的兔抗MDA5单克隆抗体、1∶500稀释的兔抗LGP-2单克隆抗体、1∶500稀释的兔抗GAPDH单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜。加入1∶2 000稀释的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育60 min，TBST洗膜。ECL发光试剂盒对PVDF膜进行曝光显影，成像扫描分析系统测定内参和目的条带的灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组细胞USP4蛋白表达

空载质粒组细胞USP4蛋白表达(0.59±0.13)明显低于空白对照组(1.23±0.25)，差异有统计学意义(P<0.05)；去泛素化酶组细胞USP4蛋白表达(2.95±0.88)明显高于空载质粒组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 各组细胞USP4蛋白表达

2.2 各组细胞EV71 mRNA表达

空载质粒组和去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达(3.77±1.96)、(1.85±1.12)明显高于空白对照组(0.02±0.01)，差异有统计学意义(P<0.05)；去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显低于空载质粒组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达

空载质粒组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；去泛素化酶组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图2。

表1 各组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达比较

图2 各组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达Western blot

3 讨 论

EV71是引起手足口病的主要病原体之一，自1974年首次报道患者体内分离EV71后，世界各地相继报道EV71感染，近些年我国EV71感染比例逐年上升[6]。目前针对EV71感染临床无特效药物，只能对症治疗，尽管近年出现了手足口疫苗，但是引起手足口病毒种类繁多，且病毒变异速度迅速，大大降低了疫苗的预防作用[7]。因此从EV71感染发生机制角度探寻有效治疗方案对提高临床疗效有重要意义。

泛素化是常见的蛋白质修饰方式之一，蛋白质泛素化修饰是可逆的过程，主要通过泛素(ubiquitin，UB)、泛素激活酶E1(ubiquitin activating enzyme E1，UBE1)、泛素结合酶E2(ubiquitin activating enzyme E2，UBE2)、泛素连接酶E3(ubiquitin activating enzyme E3，UBE3)共同完成[8]。抗病毒信号通路中的蛋白分子可受到泛素化修饰，如环指蛋白135催化RIG-Ⅰ发生K63连接，从而活化RIG-Ⅰ[9]。去泛素化酶是一类数量众多的蛋白水解酶家族，可通过催化去除底物蛋白质上的泛素从而逆转泛素化修饰过程[10]。近年来不断有新的去泛素化酶被发现和报道，研究发现的去泛素化酶中以泛素特异性蛋白酶USP为主，其相对分子质量为105 000～110 000[11]。既往文献报道[12]在猪水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)诱导的信号通路中，USP4过表达能特异性去除RIG-Ⅰ分子K48偶联的泛素链，抑制VSV复制增殖。本研究显示去泛素化酶组A-204细胞中USP4蛋白表达明显高于空载质粒组，EV71 mRNA表达明显低于空载质粒组，提示去泛素化酶USP4具有抗EV71感染作用。RLR是识别胞浆中病毒 RNA的主要受体，其介导的信号通路在抵抗病毒感染的过程中发挥着重要作用[13]。目前发现的RLR家族成员包括RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2，其中RIG-Ⅰ、MDA5均包含C端1个阻遏子结构域 (repressor domain，RD)，以及N端1个具有三磷酸腺苷(ATP)酶活性的DExD/H-box解旋酶结构域和2个半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase，caspase)激活和募集结构域(caspase activation and recruitment domain，CARD)，而LGP-2无CARD[14]。据报道[15]RIG-Ⅰ、MDA5识别相应病毒RNA结构后，可发生二聚化，引起下游信号级联反应。本研究显示空载质粒组细胞中RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显低于空白对照组，提示EV71感染抑制了RLR信号通路。去泛素化酶组细胞中RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显高于空载质粒组，提示去泛素化酶USP4可能通过激活RLR信号通路而发挥抗EV71感染作用，这可为寻找新的药物作用靶点提供新思路。

综上所述，去泛素化酶USP4可能通过激活RLR信号通路而发挥抗EV71感染作用，这可为抗EV71药物开发和临床应用提供新的方向。但去泛素化酶USP4对EV71感染的调控作用是否还可通过其他机制有待进一步研究。