中性粒细胞与淋巴细胞比值在非小细胞肺癌患者预后评估中的临床意义及相关机制研究

尹蕾 杨旭东 杨悦 牛星鉴 周晓平 姬宏飞 王一然

肺癌是最常见的恶性肿瘤，高居全球恶性肿瘤死亡率之首，其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)约占85%[1]。确定有效预后判定指标能更好指导NSCLC诊疗。有研究证实，肿瘤相关炎症反应是实体瘤肿瘤进展的关键因素[2]。中性粒细胞/淋巴细胞比值(Neutrophils to lymphocytes ratio，NLR)是反映中性粒细胞与淋巴细胞间动态平衡的炎症指标，综合反映患者免疫状态。相关研究发现，治疗前NLR水平是宫颈癌患者重要预后指标，高NLR预示患者预后不良[3]。血清淀粉样蛋白酶A(Serum amyloid A，SAA)是一种急性期蛋白，在炎症过程中，SAA表达上升，具有类似细胞因子特性及免疫相关功能[4]。目前NSCLC中NLR对患者预后的预测作用及相关机制报道较少。本研究旨在评估NLR对NSCLC患者预后的预测作用并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2007年1月—2009年12月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院收治的经胸部放射治疗±同步化疗的302例NSCLC患者做建模组，2010年1月—2010年6月的96例患者做验证组。本研究经哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审查通过，患者签署知情同意书。

1.2 随访情况

患者出院后均接受随访。前5年每6个月进行一次随访，5年后每12个月进行一次随访。获得无病生存期(Disease-free survival，DFS)和总生存期(Overall survival，OS)。DFS定义为治疗开始到疾病复发或因疾病进展导致死亡的时间；OS定义为治疗开始到死亡或末次随访的时间。末次随访时间为2018年12月。

1.3 细胞培养

人肺上皮细胞系L132和人肺癌细胞系NCI-H2170、NCI-H520、NCI-H1299、A549保存于黑龙江省肿瘤防治研究所，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2条件下培养。

1.4 提取中性粒细胞

收集4 mL健康人和NSCLC患者外周血，应用Ficoll-Hypaque法分离中性粒细胞。分别加入0 μM、0.2 μM、0.5 μM和1 μM的SAA(Peprotech，Rocky Hill，NJ)，孵育12 h。

1.5 免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)

将4 μm肿瘤组织切片，经脱蜡、水化、热修复、H2O2阻断后与SAA或CD66b抗体(Abcam，Cambridge，UK)4℃过夜。次日孵二抗，DAB显色后苏木素复染，封片，镜下观察。按染色强度和肿瘤细胞阳性百分比确定SAA阳性表达，弱染或阳性百分比≤5%为阴性；中强染或阳性百分比>5%为阳性。肿瘤内浸润的CD66b阳性中性粒细胞定义为CD66b+中性粒细胞，5%为界值。

1.6 酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

按ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，USA)说明书检测外周血SAA表达，应用Bio-Rad 680酶标仪(BioRad Laboratories，Tokyo，Japan)在450 nm波长处测吸光度。

1.7 RNA提取和定量RT-PCR

收集培养细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录试剂盒(TOYOBO，Osaka，Japan)合成cDNA，按SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(TOYOBO，Osaka，Japan)说明书，进行荧光定量PCR。引物序列如下：β-actin 5′-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3′，5′-CATCAGGATGCCAGTGGT-3′；SAA 5′-CCTGGGCTGCAGAAGTGATCAGCGA-3′，5′-AGTCCTCCGCACCATGGCCAAAGAA-3′。

1.8 蛋白质免疫印记

收集肺癌细胞及中性粒细胞，RIPA法裂解细胞，BCA法测蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶中电泳，NC转膜，封闭后，与SAA(1∶500稀释)、Caspase3(1∶500稀释)、Bcl-2(1∶500稀释)或β-actin抗体 (1∶500稀释)(Abcam，Cambridge，UK)4℃过夜，次日孵二抗(1∶10 000稀释)，ECL法显色。

1.9 流式细胞术分析

Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(Becton Dickinson，CA，USA)检测中性粒细胞凋亡。将SAA处理的中性粒细胞PBS洗后，重悬500 μL PBS中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min，Accuri C6流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.10 统计分析

SPSS 22.0软件进行统计学分析，Image J1.8.0软件分析免疫印迹条带。ROC曲线确定NLR预测NSCLC患者放疗后复发临界值，χ2检验和Fisher精确检验分析NLR与各项参数的关系。Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析NLR与OS和DFS的关系。多因素Cox回归分析预后影响因素。应用R 3.6.0软件建立列线图模型，绘制ROC曲线评估模型预测性能。Pearson线性相关分析血清中SAA与中性粒细胞数量的相关性。t检验进行两组间比较，方差分析进行多组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建模组和验证组NSCLC患者一般特征

建模组患者302例，验证组患者96例。表1结果显示，建模组和验证组临床特征差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 NLR预测NSCLC患者放疗后复发

ROC曲线显示，建模组中NLR对NSCLC患者放疗后复发有一定的诊断价值(AUC=0.679，95%CI：0.629～0.753，P=0.013)，NLR最佳分界值为2.53，敏感性为0.891，特异性为0.559；淋巴细胞绝对计数(Absolute lymphocyte count，ALC)和中性粒细胞绝对计数(Absolute neutrophil count，ANC)的诊断价值无统计学意义(P>0.05)(图1)。

2.3 NLR与临床指征关系

建模组患者分高NLR组(≥2.53，137例)和低NLR组(<2.53，165例)。高NLR组患者ANC高于低NLR组患者(4.78±0.237vs. 3.81±0.395，t=3.617，P<0.001)。表2结果显示，ECOG评分、病理分期、肿瘤分级与NLR有关(P<0.01)。

2.4 NLR与疾病进展时间关系

建模组患者分低NLR组和高NLR组，低NLR组患者OS和DFS显著延长(χ2=16.798，P<0.01；χ2=22.809，P<0.01)(图2)。

2.5 NSCLC患者预后影响因素

单因素分析显示，建模组患者NLR与OS和DFS相关(P<0.001)(表3)。多因素逐步Cox回归的最优模型中，性别与NLR是OS的独立预后因素(P<0.05)(表4)。

2.6 列线图模型的建立和验证

根据多因素Cox回归分析结果建立OS列线图模型(图3A)。OS列线图模型对建模组患者3、5年生存率预测的AUC值分别为0.723和0.625，对验证组3、5年生存率预测的AUC值分别为0.749和0.705(图3B-C)，说明模型有较好的预测性能。

图1 患者治疗前NLR、ALC、ANC的ROC曲线Figure 1 ROC curves for pre-treatment NLR，ALC and ANC in NSCLC patients

表1 建模组和验证组NSCLC患者一般特征[ n(%)]

图2 治疗前NLR水平对OS和DFS的影响Figure 2 Kaplan-Meier curves of OS and DFS based on NLR

表2 患者临床指征与NLR的关系[ n(%)]

图3 列线图模型及模型预测性能ROC曲线Figure 3 The nomogram model and ROC curvesNote：A.The nomogram model of OS；B.The ROC curve of modeling group；C.The ROC curve of validation group.

表3 影响患者预后单因素Cox分析

表4 患者预后影响因素的多因素Cox回归分析

2.7 高NLR提示预后不良机制分析

免疫组织化学结果发现血液NLR高的患者肺癌组织中中性粒细胞浸润度高，同时伴SAA高表达(图4A-D)。ELISA结果显示NSCLC患者SAA显著升高(P<0.01)(图4E)，患者SAA与中性粒细胞数量呈正相关(r=0.707，P<0.01)(图4F)。与L132细胞相比，肺癌细胞中SAA mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01)(图4G-H)。

2.8 SAA对中性粒细胞凋亡的影响

如图5A所示，与对照组相比，SAA处理中性粒细胞后显著抑制中性粒细胞凋亡，且呈剂量依赖性(P<0.05)。SAA处理后Caspase-3表达降低，Bcl-2表达升高(P<0.05)(图5B)，说明SAA抑制中性粒细胞凋亡。

3 讨论

随着肿瘤研究的深入，人们发现炎症与肿瘤间存在密切关联。中性粒细胞、淋巴细胞、淋巴细胞/单核细胞比值(Lymphocyte to monocyte ratio，LMR)及NLR都能反应机体炎症水平。本课题组在Luminal型乳腺癌和弥漫大B细胞淋巴瘤中发现，治疗前LMR与患者预后有关；治疗前NLR低的宫颈癌患者同步放化疗预后更好，NLR对化疗方案选择有提示作用[3，5]。

本研究在建模组中发现NLR<2.53的NSCLC患者比NLR≥2.53患者的生存时间更长，NLR与ECOG、病理分期和肿瘤分级有关。多因素分析显示NLR和性别是NSCLC患者OS的独立预后因素，建立OS列线图模型，验证后提示模型预测性能较好。多项研究表明治疗前高NLR提示NSCLC患者预后差，NLR可作为预后判定指标来评估NSCLC患者预后[6-8]。

图4 NSCLC患者SAA与中性粒细胞表达 Figure 4 The expression of SAA and neutrophils in NSCLC patientsNote：A-B.The positive and negative expression of SAA by IHC(100×)；C-D.The high and low infiltration of CD66b+ neutrophils by IHC(100×)；E.The concentration of SAA in plasma from 21 normal controls and 37 NSCLC patients by ELISA；F.The correlation between SAA and neutrophils；G-H.The expression of SAA at levels of mRNA and protein.##P< 0.01，when compared with the normal controls.**P< 0.01，when compared with L132 cells.

图5 SAA对中性粒细胞凋亡影响Figure 5 Effects of SAA on apoptosis of neutrophilsNote：A.The analysis of apoptosis by flow cytometry；B.The expression of apoptosis-related protein.*P< 0.05，**P< 0.01，when compared with the control group.

本研究发现肺癌组织和细胞系中SAA显著增加，有研究表明，肿瘤细胞与免疫细胞相互作用，表达并分泌SAA[9]。SAA对免疫细胞有趋化性，引起白细胞浸润、促中性粒细胞黏附，释放细胞因子[4，10]。黑色素瘤分泌SAA诱导中性粒细胞向免疫抑制型中性粒细胞分化，诱导其分泌白介素10促肿瘤生长[11]。本研究发现SAA与中性粒细胞数量呈正相关，SAA抑制中性粒细胞凋亡。Christenson等[12]研究发现SAA通过P2X7敏感通路抑制中性粒细胞凋亡，在自发凋亡和FAS诱导凋亡的细胞中均有抑制作用。抗凋亡的中性粒细胞分泌血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等炎性因子，促血管生成、诱导DNA损伤，促肿瘤发展[13-14]。

综上所述，术前NLR水平可作为预测NSCLC患者预后指标。本研究初步验证NSCLC中SAA抑制中性粒细胞凋亡，影响NLR水平。接下来本课题组将进一步研究在NSCLC中SAA抑制中性粒细胞凋亡的通路机制、SAA对中性粒细胞分泌的炎性因子的影响作用，继续探索SAA在NSCLC中所发挥的作用。