房颤冷冻球囊消融术对调控编码超速激活延迟整流钾通道蛋白的影响

黄 城，姚 娟，燕建锋，方 舒，宋迁甲

（石河子大学医学院，新疆 石河子 832000）

心房颤动（atrial fibrillation，AF）是最常见的持续性心律不齐，其发病率及死亡率均较高。据统计[1]，约1/3 的正常人有发生房颤的风险，与非房颤患者相比，其死亡风险增加了1.5～3.5 倍，中风风险增加了5 倍，认知功能下降风险增加了1.4～1.6 倍；20%～30%的房颤患者会出现心衰，16%～20%的出现抑郁，超过60%的患者存在生活质量下降，年住院率达10%～40%。目前关于房颤的发病机制尚不清楚，进一步研究房颤的潜在机制可能为房颤的提供新的治疗方法[2]。近年来，有关miRNA 对房颤的研究越来越多[3-5]。有人提出了几种miRNAs 作为房颤的生物标志物，但目前尚无可用于诊断目的[6]。目前关于miRNA 与房颤消融结果的研究较少。其他研究显示，房颤患者的血浆miR-21 水平较对照组低，导管消融后1 个月miR-21 表达增加[7]。持续性房颤患者接受消融后，循环miR-21 水平也与房颤消融结果相关[8]。基于此，本研究主要观察房颤患者外周血中miRNAs 的变化情况，探讨其对超速激活延迟整流钾通道的影响，进一步分析房颤可能的基因靶向治疗机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017 年1 月～2019 年10 月新疆维吾尔自治区人民医院经病史、心电图或动态心电图资料明确诊断为房颤，符合冷冻球囊消融术适应症并接受冷冻球囊消融术后随访3 个月无复发患者作为研究对象，共45 例，男35 例，女10 例。将术前全基因组测序作为对照组，术后测序作为试验组。纳入标准：①依据国际通用的诊断标准[9]，房颤的诊断结合既往病史、房颤时症状、体征、心电图或动态心电图明确；②左室射血分数（LVEF）≥50%。排除标准：①年龄＞75 岁；②合并甲亢，糖尿病，高血压，左室功能减低（EF＜40%），严重冠状动脉疾病，肝、肾功能障碍，急、慢性感染疾病以及心肌结构性病变。所有患者均给予相同的药物调节血压、血脂，停用β-受体阻滞剂和其他抗心律失常药物。本研究已经新疆维吾尔族自治区人民医院医学伦理委员会通过，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 实验材料与仪器 Illumina NextSeq 500 测序仪（美国Illumina 公司），anoDrop ND-1000 分光光度计（美国Nanodrop 公司），总RNA 提取试剂盒（上海羽朵生物科技有限公司），DEPC 处理水（无锡菩禾生物医药技术有限公司），氯仿（上海苏懿化学试剂有限公司20170415），无水乙醇（常熟市鸿盛精细化工有限公司20200910），SYBRGreen PCR 试剂盒（Thermo F -415XL），逆转录试剂盒（Thermo#K1622），红细胞裂解液（无锡菩禾生物医药技术有限公司），低温冷冻离心机（eppendorf 德国艾本德股份公司5417R），Real-time 检测仪（ThermoFisher Scientific 赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司ABI-7500）。

1.2.2 实验步骤 分别抽取试验组、对照组清晨空腹外周静脉血4 ml，置于EDTA 抗凝管中，2 h 内分离血浆，离心后吸取上清液置冻存管中，-80 ℃冰箱保存。提取总RNA 均采用标准试剂盒，经琼脂糖电泳和Nanodrop 质检和定量后，构建好文库，Agient 2100 Bioanalyzr 进行文库质量测定，混合好的不同样品的测序文库，通过0.1 mol/L NaOH 变性生成单链DNA 分子，在Iumina flow cell 上捕获，原位扩增为簇（cluster），根据说明，在Ilumina NextSeq 500 测序仪上进行51 个cycle 测序。测序完成后，使用Solexa CHASTITY 质控筛选原始reads 得到Clean Reads。用cutadapt 以对Clean Reads 去接头，并留下长度≥15 nt 的tag 得到trimmed reads。利用miRDeep2 软件使用所有trimmed reads 进行已知miRNA 定量和新miRNA 预测。最后用实时定量逆转录聚合酶链式反应验证和蛋白定量分析差异表达显著的基因来确保实验的准确性。其中，实验中所有研究对象血液样品中总RNA 的提取均使用总RNA抽提试剂盒，cDNA 的反转录使用逆转录试剂盒（Thermo #K1622）。以GAPDH 为内对照基因，采用2-△△CT法计算各组中基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 mcirRNA 水平实时定量逆转录聚合酶链式反应引物序列

1.3 观察指标 比较两组miRNA 表达差异，并通过mirbase、miranda、targetscan3 个数据库进行靶基因分析，对存在差异的miRNA 进行实时定量逆转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹法验证。

1.4 统计学处理 实验数据录入Excel 表格，应用SPSS 23.0 软件包和ABI Prism 7500 SDS Software软件进行统计分析，计量资料以（）表示，比较采用t检验；计数资料以（n）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miRNA 表达比较 全基因组测序显示，两组miRNA 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中has-miR-134-5p 等15 个miRNAs 术后下调，has-miR-1255a 等6 个miRNAs 术后上调，见表2。

2.2 两组miRNA 靶基因预测 通过设定阈值为1.5倍差异，P≤0.05 且组内CPM 均值≥1 来筛选差异表达的miRNAs，结果显示，代表KCNA5 的hsamiR-4433b-3p miRNA 与房颤密切相关，术前定量表达的CPM 值为0.741，术后CPM 值为-1.643，术前与术后相比表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 两组KCNA5 蛋白表达量比较 RT-PCR 结果显示，试验组血清中KCNA5 表达水平较对照组下调[（0.398±0.060）vs（1.000±0.035）]，差异有统计学意义（t=15.996，P=0.004）。Western Blot 检测显示，与对照组相比，试验组KCNA5 的表达水平降低，见图1、图2。

3 讨论

心脏细胞中的超快速延迟整流器（IKur）电流由电压门控钾离子通道Kv1.5 介导，它通过影响心房肌细胞动作电位时程（APD）和有效不应期（ERP）影响心房的正常节律和频率，房颤的发生发展与电压门控钾离子通道有着千丝万缕的关系。而Kv1.5 蛋白由KCNA5 基因编码，已有研究[10]表明KCNA5 基因单核苷酸多态性rs3741930 位点与特发性房颤（IA）发生风险有关，特发性房颤患者KCNA5 基因通常携带C 等位基因。Ni H 等[11]通过使用多尺度机电模型强调了IKur 在调节人心房收缩性中的重要作用，功能获得性KCNA5 突变对心房收缩力有严重损害。王汝朋等[12]发现房颤患者超快激活的延迟整流钾电流通道表达下调显著的是KCNA5 基因，较为显著的更多的是钾离子通道，预示房颤电重构与钾离子通道重构有着密切联系。

表2 两组miRNA 表达比较

图1 KCNA5 蛋白表达量条形图

图2 KCNA5 蛋白表达的Western Blot 图

本次研究发现，试验组患者外周血中miRNA 水平与对照组完全不同，手术可能作为外在因素通过逆转KCNA5 的电重构，从而影响miRNA 的表达使房颤离子通道离子流失调，提示miRNA 可能通过改变心房细胞的电生理特性而参与了房颤的发病过程。miRNA 是一类保守非编码分子，长度约为18～25 个核苷酸，它能够抑制mRNA 翻译或者沉默目的基因，抑制转录后水平上靶基因表达[13]，其原理是通过与其靶基因mRNA 的3' 非翻译区碱基配对结合。据报道，miR 122、miR-155-5p、miR-24-3p、miR-223 与房颤的进展有关[14，15]。在由miRNA 的致病性上调引起的疾病中，敲除方法（如miRNA 海绵）可用于将上调的致病性miRNA 恢复到正常水平[16]。Lu Y 等[17]采用微阵列分析方法评估了犬模型和房颤患者心房样本的miRNA 表达谱，通过实时定量逆转录聚合酶链式反应进行了验证，结果发现miR-223、miR-328 和miR-664 随房颤发生显著上调，而miR-101、miR-320 和miR-499 表达下调。早期研究表明[18]，射频消融术通过影响房颤患者离子通道蛋白表达，从而促进离子通道电流再平衡，miRNA-1266 等miRNAs 有可能是房颤未来新的干预靶点。本次研究发现，试验组hsa-miR-4433b-3p 表示上调，RT-PCR 验证和蛋白定量分析显示作为调控超速延迟整流钾通道上动作电位平台期钾离子外流的通道蛋白KCNA5 基因表达较对照组增加，钾离子在平台期外流增加，而试验组则相反。考虑房颤的电重构可能与超速延迟整流钾通道的离子通道蛋白重构和离子流改变有关，冷冻球囊手术改变了房颤的离子通道蛋白重构，使表达调控的miRNAs 增加。Colman MA 等[19]研究明确了KCNA5 基因的6 个新突变，这些突变体同时表现出心房特异性超速延迟整流钾通道电流的功能获得和功能丧失，并阐明和量化这些KCNA5 突变对心房电活动的功能影响，与本研究结果一致。

本研究选择了代表调控超速激活延迟整流钾通道蛋白miRNA 的KCNA5 基因进行了RT-PCR 验证，校正用内对照基因（管家基因GAPDH）。两组表达差异结果与测序结果大致相同，上调或下调的趋势相同，RT-PCR 验证与蛋白定量分析结果一致，提示冷冻球囊手术改变了超速延迟整流钾通道离子流原始平衡状态，起到了再平衡作用，对调控心脏超速激活延迟整流钾通道蛋白的miRNA 存在一定影响，提示hsa-miR-4433b-3p 可能为房颤的潜在生物标志物。

综上所述，冷冻球囊消融术影响了房颤离子流的动态平衡，调控编码超速激活延迟整流钾通道蛋白的hsa-miR-4433b-3p 等miRNAs 有可能为房颤新的生物标识物和潜在的治疗靶标。