结直肠癌组织中MMP-7及TS表达与癌细胞侵袭生长的相关性*

代祥军，吴国华

重庆大学附属三峡医院:1.肿瘤放疗消化病区；2.肿瘤放疗综合病区，重庆 404000

结直肠癌是全球高发的消化道恶性肿瘤之一，全球每年新发直肠癌病例超过120万，超过50%患者死亡，病死率居恶性肿瘤第3位[1]。结直肠癌恶性程度较高，易发生侵袭转移，严重影响患者预后[2]。探讨结直肠癌细胞侵袭行为相关机制，有助于为临床治疗和预后提供理论依据和指导。基质金属蛋白酶7(MMP-7)是MMPs家族中参与降解细胞外基质的重要酶之一，在恶性肿瘤中通过促使细胞突破基底膜和细胞外基质限制，引发肿瘤细胞侵袭性行为的发生[3]。胸苷酸合成酶(TS)是合成胸苷酸的关键酶，参与肿瘤细胞DNA合成，与肿瘤浸润、侵袭转移、复发关系密切[4]。MMP-7、TS在结直肠癌中的报道较多，但与癌细胞侵袭生长相关的报道并不多见，本研究拟通过检测81例结直肠癌患者组织中MMP-7、TS及癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白表达，探讨MMP-7、TS与结直肠癌侵袭生长的关系，以进一步明确MMP-7、TS在结直肠癌中的生物学行为特征，为临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年6月至2019年3月重庆大学附属三峡医院(以下简称“本院”)肿瘤科收治的81例经手术切除的结直肠癌组织标本(结直肠癌组)。纳入标准：(1)行结直肠癌根治手术，术后病理学证实为结直肠癌；(2)临床资料完整；(3)年龄18岁以上。排除标准：(1)检查前已经接受手术、放疗或化疗等形式治疗；(2)合并其他部位肿瘤或结直肠转移瘤；(3)妊娠或哺乳期患者。结直肠癌组中男49例，女32例；年龄53～69岁，平均(60.32±4.19)岁。另选择同期于本院门诊行肠镜检查的72例结肠息肉、结肠炎组织标本为对照组，均于肠镜下取组织活检，经HE染色排除癌变。其中男41例，女31例；年龄50～67岁，平均(61.78±4.06)岁。两组年龄、性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得本院伦理会批准，患者及其家属均知情同意签署同意书。

1.2方法 取制备好的石蜡组织标本，加入二甲苯脱蜡后再用无水乙醇脱二甲苯，而后切取100 mg组织标本匀浆研磨，离心弃上清液。TRIzol(美国Sigma公司)法提取总RNA，检测纯度和完整性，取20 μg RNA标本，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(Epicentre 公司)将RNA逆转录为cDNA。CFX96实时荧光PCR仪(美国Bio-Rad)检测MMP-7、TS以及癌细胞增殖蛋白[叉头盒蛋白A1(FOXA1)、程序性细胞死亡基因4(PDCD4)、Xklp2靶蛋白(TPX2)]、侵袭相关蛋白[N-钙黏附素(N-CD)、上皮钙黏附素(E-CD) 、Twist相关蛋白1(TWIST1)、Yes相关蛋白(YAP)]表达。以U6 为内参，相对定量法计算MMP-7、TS，癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白在各组相对表达量，ΔΔCt目标相对表达量=ΔCt目标表达-ΔCtU6。

2 结 果

2.1结直肠癌组和对照组MMP-7、TS水平比较 结直肠癌组MMP-7、TS水平高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 结直肠癌组和对照组MMP-7、TS水平比较

2.2结直肠癌组和对照组癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白水平比较 结直肠癌组FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均高于对照组(P<0.05)，E-CD低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 结直肠癌组和对照组癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白水平的比较

2.3结直肠癌患者MMP-7、TS表达与癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白相关性 相关分析显示，结直肠癌患者MMP-7、TS水平与FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均呈正相关(P<0.05)，与E-CD水平呈负相关(P<0.05)，见表3。MMP-7、TS水平之间呈正相关(r=0.642，P<0.001)。MMP-7与TWIST1、YAP水平的相关系数高于TS(Z=11.340、10.937，P<0.001)。

表3 结直肠癌患者MMP-7、TS水平与癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白的相关性分析

3 讨 论

结直肠癌早期无典型症状，确诊时多数患者处于中晚期，失去根治手术机会，预后差[5]。侵袭性是癌细胞重要生物学特性，与肿瘤转移抑制基因、细胞外基质降解、上皮间质转化、微环境改变、新生血管形成、细胞黏附等因素有关[6]，了解与结直肠癌肿瘤侵袭机制相关的分子机制可遏制肿瘤进展，改善患者预后。

MMP-7是具有基质降解活性和底物特异性的MMPs，发挥调控细胞生长、分化和凋亡等作用[7]。TS是在核酸代谢通路中起关键调节作用的限速酶，TS过度表达可促使肿瘤细胞增殖，其水平反映肿瘤细胞增殖状态[8]。本研究结果显示，结直肠癌患者癌组织中MMP-7、TS水平增高，提示MMP-7、TS与结直肠癌的发病机制有关。MMP-7具有广泛的蛋白水解活性，MMP-7过表达可促使癌变，加速癌细胞增殖、浸润和转移[9]。TS可能通过调节p53表达影响细胞周期，促使细胞恶变，加速细胞生长增殖[10]。

在癌细胞侵袭性生长过程中，多种增殖蛋白和侵袭相关蛋白均参与其中。FOXA1通过调控G1/S细胞周期加速细胞增殖[11-12]。PDCD4可抑制G1期增殖，参与癌细胞凋亡[13]。TPX2作为一种微管相关蛋白，其异常表达可诱导细胞中心体异常扩增和恶性转化，并促进细胞增殖，影响细胞周期和凋亡[14]。上皮间质转化是癌细胞增殖后获取向临近和远处组织转移能力的基础，E-CD、N-CD作为上皮间质转化分子标志物，在恶性肿瘤中E-CD表达减少，N-CD表达增多，导致细胞间极性降低，癌细胞向邻近组织侵袭以及向淋巴结和远处转移[15]。TWIST1是上皮间质转化信号通路的关键转录因子，其高表达可促使恶性肿瘤的上皮间转化和远处转移[16]。YAP通过转录激活凝血酶敏感素1/黏着斑激酶信号促进病灶粘连和肿瘤侵袭[17]。本研究结果显示，结直肠癌组FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均高于对照组，E-CD水平低于对照组，说明癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白改变与结直肠癌发生有关，并验证了结直肠癌恶性增殖和侵袭的生物学特性。

相关分析结果显示，结直肠癌患者MMP-7、TS水平与FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均呈正相关(P<0.05)，与E-CD水平呈负相关(P<0.05)，说明MMP-7、TS与结直肠癌细胞侵袭行为有关。细胞外基质降解与肿瘤侵袭行为关系密切，癌细胞通过穿透宿主细胞组织，向邻近或远处组织侵袭涉及细胞外基质的破坏，MMP-7作为基质降解活性较强的MMPs参与癌细胞增殖、侵袭过程[18]。GUO等[18]报道显示MMP-7与宫颈癌盆腔淋巴结及腹主动脉旁淋巴结转移有关。结直肠癌局部复发、腹腔盆腔内播散病灶中TS基因表达增强，肿瘤细胞DNA合成增加，导致癌细胞加速生长、增殖，引起肿瘤侵袭、播散[19]。TS过度表达上调可能导致对5氟嘧啶耐药，从而导致肿瘤复发和盆腔内转移[20]。进一步分析MMP-7、TS与癌细胞增殖蛋白、侵袭相关蛋白关联程度大小，发现MMP-7与TWIST1、YAP蛋白表达相关系数高于TS，TWIST1、YAP蛋白均与癌细胞侵袭转移有关，提示MMP-7可能在直肠癌细胞侵袭性生长过程中发挥更关键作用。本研究结果显示MMP-7、TS水平也呈正相关，提示MMP-7、TS在结直肠癌侵袭行为中可能发挥协同作用。

综上所述，结直肠癌患者癌组织中MMP-7、TS表达升高，高表达MMP-7、TS可能参与癌细胞侵袭过程。MMP-7、TS水平的检测可为结直肠癌病情评估提供参考。