海金沙中非法添加柠檬黄的快速鉴别研究

王 康，郭 舟，张 勤，陈建玲，吴 竞

（湖北省襄阳市公共检验检测中心，湖北 襄阳 441004）

海金沙为海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw. 的干燥成熟孢子，有清利湿热、通淋止痛功效，主要用于热淋、膏淋、血淋、石淋、尿道涩痛等的治疗［1］。海金沙由于药用部位的特殊性，采收难，产量低，市场需求较大，导致其价格不断上涨，由于利润的驱使和市场监管不到位等原因，市场上部分海金沙药材长期存在杂质过多、掺泥沙或其他物质增重等质量问题［2-3］。近年来，全国中药材及饮片质量分析报告和湖北省药品质量公告中，不合格批次较多的中药材、饮片中屡屡出现海金沙，不合格项目主要为性状、显微鉴别和总灰分［4-6］。2019 年5 月至2020 年6 月，湖北省襄阳市药品监督抽检过程中对部分海金沙药材样品进行薄层色谱鉴别时，发现其甲醇溶液呈显著黄色，疑似非法添加了水溶性色素柠檬黄。由于2015 年版《中国药典（一部）》海金沙项下无色素检查项，相关的补充检验方法也处于空白状态；同时，海金沙中非法添加柠檬黄色素也未见类似报道。本研究中采用水试法进行初筛、薄层色谱鉴别检查是否非法添加柠檬黄，并采用高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法进行验证。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪，包括SPD-M20A 型二极管阵列检测器（日本Shimadzu 公司）；ZY-600U 型薄层色谱自动成像分析系统（北京先驱威锋技术开发公司）；XS205 型电子天平（精度为0.01 mg）、AL204 型电子天平（精度为0.1 mg），均购自瑞士梅特勒-托利多公司；HU-6150B 型超声波清洗器（天津恒高电气科技有限公司）。

1.2 试药

柠檬黄对照品（中国食品药品检定研究院，批号为510004-202003，含量为93.4%）；硅胶G 板（青岛海洋化工有限公司）；海金沙药材9 批（来源见表1）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

表1 海金沙药材来源Tab.1 Source of Lygodii Spora

2 方法与结果

2.1 水试法初筛

取药材样品1 ～9 号各5 g，分别置50 mL 烧杯中，加水40 mL，搅拌5 min，静置10 min，滤过，取续滤液，得供试品溶液。另取柠檬黄对照品适量，同法制备对照品溶液。上述溶液各取20 mL，置25 mL 纳氏比色管中，同置白色背景前，在自然光下平视观察，结果药材样品5、样品6 供试品溶液呈现与对照品溶液类似且显著的黄色，初步判断可能非法添加了色素柠檬黄。详见图1。

1-9. 供试品溶液 S. 对照品溶液图1 水试法比色图1 -9. Test solution S.Reference solutionFig.1 Colorimetric picture of aqueous solution test

2.2 薄层色谱法检查

取药材样品1 ～9 号各5 g，分别加70%乙醇40 mL，超声（150 W，40 kHz，下同）处理20 min，离心，取上清液，得供试品溶液。另取柠檬黄对照品适量，加70%乙醇，制成质量浓度为0.1 mg／mL 的对照品溶液。照2015 年版《中国药典（四部）》通则0502“薄层色谱法”试验，吸取各供试品溶液和对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1 ∶3 ∶3 ∶1 ∶1，V／ V／ V／ V／ V）为展开剂，二次展开，取出，晾干，在可见光下检视。结果见图2。药材样品5、样品6 供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同的黄色斑点，故判断药材中非法添加了色素柠檬黄。

1-9. 供试品溶液 S. 对照品溶液图2 薄层色谱图1 -9. Test solution S.Reference solutionFig.2 TLC chromatograms

2.3 验证试验

2.3.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent Eclipse XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A） -0.05 mol／L 乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0 ～30 min 时5%A→45%A，30 ～40 min 时45%A→5%A，40 ～45 min 时5%A）；流速：1.0mL／min；检测波长：432nm；柱温：35℃；进样量：10μL。

2.3.2 溶液制备

取柠檬黄对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL 约含10 μg 的对照品溶液。取高度怀疑非法添加了柠檬黄的药材样品5，6 各5 g，分别加70%乙醇40 mL，超声处理20 min，离心，取上清液，得供试品溶液。取确定未添加柠檬黄的样品，同法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 测定法

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱中，应不得出现与对照品溶液色谱相同保留时间处的色谱峰；若出现，则采用紫外-可见分光光度法比较色谱峰在190 ～760 nm 波长范围内光谱的吸光度，吸光度应不相同。

2.3.4 结果判定

依法测定，结果见图3 和图4。样品5、样品6 供试品溶液色谱中，均与对照品溶液相应色谱保留时间完全相同，相应的光谱图也完全相同，而阴性对照品溶液则无相应色谱峰。结果确证样品5、样品6 均添加了色素柠檬黄。

3 讨论

2018 年8 月，全国范围内开展中药饮片质量集中整治后，中药饮片的质量有很大改善，但仍存在极少部分中药材染色现象［5-6］。文献报道发现有染色问题的中药品种涉及延胡索［7］、蒲黄［8-9］、黄连［8，10］、西红花［11］、红花［12］、丹参［13］、黄芩［14］等，主要采用薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法对药材中的人工合成色素进行定性及定量检测［15-16］。

1. 柠檬黄A. 对照品溶液 B. 药材样品5 供试品溶液 C. 药材样品6 供试品溶液 D. 阴性对照品溶液图3 高效液相色谱图1.lemon yellowA.Reference solution B.Test solution of sample Ⅴ C.Test solution of sample Ⅵ D.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

A. 对照品溶液 B. 药材样品5 供试品溶液 C. 药材样品6 供试品溶液图4 紫外-可见吸收光谱图A. Reference solution B.Test solution of sample Ⅴ C. Test solution of sample ⅥFig.4 UV-Vis absorption spectrograms

本研究中对海金沙采用水试法进行色素检查初筛，该经验鉴别法具有操作简单、快速、结果易判断的特点，对于判断海金沙是否非法添加水溶性色素柠檬黄有很好的参考价值，可在药品监督检验中更高效地发挥快速初筛作用。初筛阳性样品需通过薄层色谱法进行进一步检查，其操作简单，试验成本低，但同时检测多种色素时分离度较差，易出现假阳性干扰，且灵敏度较低，不能作为确证方法。高效液相色谱法可利用色谱峰的保留时间和紫外-可见吸收光谱图进行定性判断，具有专属性强、灵敏度高、分离度好的特点，可用于柠檬黄的定性确证和定量分析。

经国家药品监督管理局批准的补充检验方法是非法添加色素监督检验的重要依据，是中药材染色问题监管的重要科学手段。各级食品药品检验机构在最近10 年的监督抽验中，通过应用经批准的补充检验方法，检出大批量的掺假染色中药材，有力打击了中药材非法添加的违法行为。鉴于海金沙尚无相关色素非法添加的检验方法，本研究中建立的海金沙中柠檬黄的快速检测方法，操作简单、快速、准确，可用于申报海金沙中柠檬黄检查的补充检验方法。