秸秆连续还田对苏打盐碱水稻土养分及真菌群落的影响

李红宇， 王志君， 范名宇， 刘梦红，吕艳东，刘丽华

(黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室，黑龙江 大庆 163000)

中国作为一个农业大国，秸秆总产量总体上呈不断增长之势，在过去的几十年里，农作物秸秆的年平均增长率约为4%[1]，中国已经成为世界上秸秆年产量最高的国家之一，但秸秆利用率却不足 50%[2]。目前燃烧秸秆现象严重，造成资源浪费、环境污染，使农田生态平衡遭受破坏[3]。如何有效处理农作物秸秆已成为农业生产、环境保护面临的紧迫问题。作物秸秆本身含有丰富的氮、磷、钾等营养元素，秸秆还田不仅能够解决环境污染问题，还能改善土壤结构和土壤理化性质、为土壤提供养分，从而减少肥料投入[4-7]，同时还能提高作物产量[8-9]，是农业可持续发展的有效措施之一[10-11]。

水稻是世界上重要的粮食作物，一半以上的人口以稻米为主食[12]。东北地区是我国重要的商品粮生产基地，对保障中国的粮食安全起着重要作用。而东北地区苏打盐碱地总面积达500万hm2[13]，是世界三大苏打盐碱土集中分布区之一，与滨海或内陆盐碱土相比，苏打盐碱土的pH值高、通透性差、肥力低下，从而制约其在农业上的开发利用[14]。在未来全球气候变暖日益加剧的情景下，土壤盐渍化问题还将日趋明显[15]，构成对土壤和农业生产的重要威胁[16]。土壤微生物是土壤重要的组成部分，是秸秆分解、转化以及土壤中能量和养分循环的关键因素[17-18]，其对外界条件(如土壤类型、pH值、作物根系分泌物等)变化十分敏感[19]，是评价土壤质量和健康状况的重要指标之一[9]。秸秆长期还田能够促进微生物的生长，提高微生物多样性和酶活性[20-21]，改变群落结构[22-24]。真菌具有很强的纤维素降解能力，能降解作物秸秆中含有的纤维素、半纤维素和木质素[25]，在秸秆还田的过程中发挥重要作用[26]。

目前，关于秸秆还田对土壤改良以及土壤微生物群落影响的研究成果层出不穷，但是以水稻秸秆作为材料来研究秸秆还田对苏打盐碱地改良效果的报道较少，其改良机制也尚未明确。本研究探讨了不同量水稻秸秆连续多年还田对土壤养分和真菌群落结构特征的影响及二者的相关关系，以期为苏打盐碱地土壤改良和秸秆资源的高效循环利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

黑龙江省大庆市(119°23′E，26°10′N)属东北半湿润—半干旱草原—草甸盐渍区，土地盐碱化类型以苏打碱化草甸土、沼泽化草甸土和苏打盐化草甸碱土为主，土壤在盐化的同时伴随着碱化过程。该地年日照时数2 726 h，无霜期166 d，年平均气温4.2℃，夏季平均气温23.2℃，农作物生长发育期气温日差达10℃以上，年降水量427.5 mm，年蒸发量1 635 mm。

试验于2014—2018年在大庆市黑龙江八一农垦大学校内盆栽试验基地进行。供试土壤于2014年取自黑龙江八一农垦大学校内0～15 cm土层的苏打盐化草甸碱土，土壤理化性质如表1所示。供试品种为垦鉴稻5号，主茎12片叶，株高87～90 cm，需≥10℃活动积温2 450℃～2 500℃。

表1 供试土壤养分含量(2014年)

1.2 试验设计

采用盆栽试验，单因素完全随机设计，水稻秸秆每年还田量设置5个水平，分别为0(CK)、3.0(RS1)、7.5(RS2)、12(RS3) t·hm-2和16.5 (RS4) t·hm-2，3次重复，每次重复种植4盆。第1年春季将采集的盐碱土风干、粉碎、混匀，之后取12 kg盐碱土与长度约5 cm的定量水稻秸秆混拌均匀，装入盆钵(盆钵高30.5 cm，内径30 cm)，将基肥埋入土层10 cm深处，加水至水层稳定，人工搅浆模拟水整地。插秧规格为每盆4穴，每穴3苗。每年收获后每个盆钵土壤原状保留，春季粉碎，与秸秆混拌后装入原盆钵。每年每处理还田量及管理措施相同，秸秆连续还田5 a。施用的肥料为尿素、硫酸铵、磷酸二铵和硫酸钾。基肥N、P、K的施用量分别为39.6(N)、69(P2O5)、42(K2O) kg·hm-2，分蘖肥和调节肥N的施用量分别为28.35 kg·hm-2和9.35 kg·hm-2，穗肥N和K的施用量分别为14.39(N) kg·hm-2和28.5(K2O) kg·hm-2。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤取样方法 2018年(秸秆连续还田第5年)6月中旬(水稻分蘖期)，使用土壤取样器采集0～10 cm土壤样品，3次重复，每次重复为4盆各3个样点的混合样。每份土样分为2份，其中一份装入无菌密封袋后，迅速置于液氮中带回实验室，在-80℃下保存，供土壤微生物种群结构多样性分析；另一份置于避光通风处风干，除去砂砾石块和植物残体，过2 mm筛，用于土壤养分含量测定。

1.3.2 土壤基本理化性质测定 土壤pH采用电位法测定；有机质含量采用重铬酸钾法测定；全氮含量采用凯氏定氮法测定；碱解氮含量采用碱解扩散法测定；全磷含量采用碳酸钠熔融—钼锑抗比色法测定；有效磷含量采用碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法测定；全钾含量、速效钾含量采用火焰光度法测定。以上各方法均参照鲁如坤[27]的方法。

1.3.3 土壤总DNA的提取、真菌ITS序列的PCR扩增及高通量测序 称取0.5 g土样，利用mobio土壤微生物DNA强力提取试剂盒PowerSoil®DNA Isolation Kit进行DNA提取，使用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计，对DNA的纯度、浓度和完整性进行检测。对样本进行ITS1区域的扩增，引物为5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。PCR扩增第一步反应体系为50 μl，反应程序：95℃预变性5 min；15个循环(包括95℃，1 min；50℃，1 min；72℃，1 min)；72℃，7 min；4℃保温。将PCR产物用磁珠进行纯化。第二步反应体系为40 μl，反应程序：98℃预变性30 s；10个循环(包括98℃，10 s；65℃，30 s；72℃，30 s)；72℃，5 min。将第二步PCR产物用磁珠纯化后进行Nanodrop 2000定量，按照质量比1∶1进行混样。采用Illumina Hiseq 2500平台(Illumina Corporation，USA)，2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序。土壤微生物总DNA的提取、测序委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.4 数据处理

使用USEARCH方法，对各样品的Effective Tags进行聚类，将序列相似性达到97%的序列聚类生成操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)；使用Mothur(version v.1.30)软件对样品Alpha多样性指数进行评估；采用R软件对OTU丰度进行主坐标分析(PCoA)并制图，研究不同处理间群落结构组成差异；使用冗余分析(RDA)研究土壤理化性质和微生物群落结构之间的关系。采用Excel 2003进行数据整理，用DPS v7.05软件进行方差分析，运用 GraphPad prism6.02 软件完成画图。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤理化性质的比较

表2结果表明，全磷、有效磷和速效钾含量随着秸秆还田量的增加呈增加趋势，各处理均显著高于对照。添加秸秆后提高了土壤pH和全钾含量，RS1～RS4处理的pH值均显著高于对照，全钾含量各处理之间差异不显著。有机质含量呈现RS4>RS3>CK>RS2>RS1，RS4处理显著高于对照和其他处理。各处理的全氮含量均显著低于对照，RS2和RS4处理的碱解氮含量显著高于RS1和RS3，与对照间差异不显著。

表2 不同处理土壤理化性质的比较

2.2 不同处理土壤真菌相对丰度的比较

排名前10的真菌门分别为子囊菌门(Ascomycota)、Aphelidiomycota、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、轮虫门(Rotifera)、单毛壶菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、黄藻门(Anthophyta)、毛霉亚门(Mucoromycota)。本文着重分析秸秆还田后相对丰度产生显著差异的菌门(图1)。子囊菌门相对丰度最高，范围为15.731%～68.177%，秸秆还田后其相对丰度呈现增加的趋势，RS4处理达到了最大值，显著高于对照和其他处理。RS1处理中Aphelidiomycota、轮虫门和黄藻门的相对丰度显著高于对照和其他处理。RS2～RS4处理的Aphelidiomycota相对丰度显著低于对照，轮虫门和黄藻门相对丰度与对照间差异不显著。随着秸秆添加量的增加担子菌门和被孢菌门相对丰度呈现先降低后增加的趋势，RS4处理达到了最大值，显著高于其他处理。

注：不同小写字母表示Duncan多重比较不同处理在5%水平下差异显著。下同。

进一步分析秸秆连续还田对其相对丰度影响较大的真菌属(图2)。相对丰度排名前三的菌属分别为裂壳菌属(Schizothecium)、柄孢壳属(Zopfiella)、腐质霉属(Humicola)，其相对丰度变化范围为2.395%～33.368%、0.048%～16.892%、0.185%～0.722%。随着秸秆添加量的增加，裂壳菌属、柄孢壳属的相对丰度呈现增加的趋势，除了RS1处理外，其他处理均显著高于对照。腐质霉属的相对丰度变化趋势为RS2>RS4>RS1>RS3>CK，其中RS2和RS4处理均显著高于对照。添加秸秆后链格孢属、枝孢属的相对丰度几乎都显著低于对照，被孢霉属的相对丰度除了RS4处理显著高于对照外，其他处理均显著低于对照。综合表明RS1和RS4处理对真菌门和属相对丰度影响较大。

图2 不同处理对真菌属水平上物种相对丰度的影响

2.3 不同处理土壤真菌群落多样性的比较

在97%相似度水平下，各处理OTU数和Alpha多样性统计结果如表3所示。样本测序深度指数值均在99.9%以上，表明测序深度包括了样品中的绝大多数真菌类型，测序数据量合理。真菌OTU数量在302～406之间，各处理均低于对照，其中RS2和RS4处理与对照间差异达到显著水平。以Chao1和ACE指数衡量物种丰度即物种数量的多少，各处理的Chao1和ACE指数均显著低于对照。Simpson和Shannon指数用于衡量物种多样性，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高。RS1～RS4处理的Simpson值高于对照、Shannon值低于对照，除RS1外，其他处理与对照间的差异均达到了显著水平。综上，表明秸秆还田降低了土壤真菌OTU数目和Alpha多样性。

表3 不同处理土壤真菌群落丰富度指数和多样性指数

2.4 不同处理土壤真菌群落结构的比较

为研究秸秆连续还田后真菌群落结构的变化，基于OTU层次进行PCoA分析，选取贡献率最大的主坐标组合(图3)。第一、二主坐标轴对真菌群落结构变异的解释量分别为19.66%和12.82%。各处理的3次重复距离较接近，表示同一处理的样品群落结构相似度较高。RS1～RS4处理与对照明显区分开，RS1～RS3处理在PC2轴上的投影较为接近，RS4在PC2轴上的投影与其他处理明显区分开。说明添加秸秆改变了土壤真菌群落结构，高还田量对其影响更为显著。

图3 不同处理主坐标分析

将土壤理化特性与相对丰度排名前10的真菌属进行RDA分析(图4)，明确影响群落结构变化的环境因子。图中射线与射线之间的关系由夹角表示，钝角代表负相关，锐角代表正相关。RDA分析表明，2个主要轴特征值分别为18.74%和 12.13%。腐质霉属与全钾、pH、有效磷、全磷、速效钾含量成正相关，柄孢壳属、裂壳菌属除了与上述环境因子呈正相关外，还与有机质、碱解氮含量成正相关。被孢霉属与全磷、速效钾、有机质、碱解氮以及全氮含量呈正相关，链格孢属、枝孢属与碱解氮以及全氮含量呈正相关。针对土壤真菌区系结构和土壤理化指标的Mantel test结果表明(表4)，全磷、有效磷、全钾、速效钾以及有机质含量与真菌群落结构差异达到了显著和极显著水平，其中有效磷和速效钾含量对群落结构的影响最大。

注：TP：全磷；AK：速效钾；OC：有机质；AN：碱解氮；TN：全氮；TK：全钾；AP：有效磷。Schizothecium：裂壳菌属；Mortierella：被孢霉属；Alternaria：链格孢属；Phlebopus：脉柄牛肝菌属；Cladosporium：枝孢属；Endochytrium：内囊壶菌属；Humicola：腐质霉属；Zopfiella：柄孢壳属。

3 讨 论

3.1 秸秆连续还田对苏打盐碱水稻土理化性质的影响

作物秸秆本身含有丰富的氮、磷、钾等营养元素，还田后养分得到释放，能够改善土壤肥力状况和养分循环[4,6]。已有大量的研究表明秸秆还田可以显著提高速效养分的含量[9,28-29]。本研究发现秸秆连续还田5 a后，全磷、有效磷和速效钾含量随着秸秆还田量的增加呈增加趋势，均显著高于对照。Su等[30]在秸秆长期还田试验中也得到了相同的结论。分析原因是秸秆中含有较多的钾，且主要是以K+形态存在，还田后随着土壤淋溶逐渐转移到土壤溶液中再被土壤吸附。磷含量和有效磷增加的原因一是秸秆中含有磷，二是由于长期秸秆还田的投入可能带入大量有机物料促进土壤有机质积累，土壤有机质可以促进活性形态磷的积累，降低非活性磷素占总磷的比重[31]。本试验秸秆还田后，土壤中的全氮含量显著低于对照，因为水稻秸秆中C/N显著大于微生物自身的C/N，微生物除了合成自身生长所需要的C/N，为了利用多余的碳，会继续从土壤中吸收氮，从而造成土壤总氮和碱解氮的损失[22]。所以在秸秆还田的同时配施适量氮肥，使植物秸秆更易分解，快速转化成土壤中的养分，从而提高作物产量[32]。

表4 Mantel 检验分析

秸秆本身所含有的丰富有机成分和营养元素，通过秸秆还田可作为土壤有机质的有效补充，对土壤有机质含量的增加产生显著的正效应。已有大量研究指出，秸秆还田能够增加土壤有机质含量[28,33-34]。本研究结果表明，参试土壤有机质基础值为18.0 g·kg-1，连续秸秆还田5 a后，不还田对照及各秸秆还田处理土壤有机质含量均大幅度提高，但是还田量0、3.0、7.5、12 t·hm-2处理之间差异并未达到显著水平，显著低于还田量为16.5 t·hm-2处理。同时发现各个处理的pH值均显著高于对照，还田量3.0 t·hm-2的pH值最高。这与李鹏[22]、Zhang[35]等研究结果一致，即秸秆还田增加了土壤的pH值。添加秸秆和生物炭后土壤的pH值呈现增加的原因可能是他们本身的碱含量[36-37]。水稻秸秆分解后碱基阳离子的释放，主要是钾的释放，是土壤pH值升高的主要原因[35]。也有学者研究指出秸秆还田后土壤的pH值降低[24,38]，或者没有显著变化[39]。这可能是作物秸秆和土壤本身的pH值不同，以及秸秆还田方式和还田时间的不同造成了试验结果的不同。

3.2 秸秆连续还田对土壤真菌相对丰度的影响

秸秆还田为土壤中的微生物提供了丰富的碳源和多种养分元素，有利于微生物的生长繁殖以及活性的提高。水稻秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素和木质素[25]，真菌具有很强的纤维素降解能力，在秸秆还田的过程中发挥重要作用[26]。本文着重分析了生物炭还田后相对丰度发生显著变化的菌门和菌属。子囊菌门、 接合菌门、担子菌门为土壤三大常见真菌类[24,32]。本研究中排名前三的菌门为子囊菌门、Aphelidiomycota、担子菌门。无论是短期的培养试验还是长期的定位试验，都发现添加秸秆后子囊菌门的相对丰度显著增加[24,40]。本研究也得到了相同的结论，即秸秆还田增加了子囊菌门的相对丰度。代红翠等[41]研究发现秸秆双季还田担子菌相对丰度高于单季还田，说明担子菌门的相对丰度受到秸秆还田量的影响。本研究中当还田量为16.5 t·hm-2时，担子菌门的相对丰度显著高于其他处理。Aphelidiomycota相对丰度仅次于子囊菌门，它不是典型的土壤真菌，相关报道较少[42-43]，有待于进一步研究。本研究发现秸秆还田增加了一些菌门菌属相对丰度的同时也降低了部分菌门菌属的相对丰度，推测原因有两方面：一是添加秸秆后改变了土壤的理化性质，从而促进或抑制了部分菌门和菌属的生长；二是添加秸秆后提高了分解纤维素的微生物活性[40],例如子囊菌已被证明能够降解纤维素和木质纤维素[44]。

3.3 秸秆连续还田对土壤真菌多样性的影响

真菌构成了土壤的大部分微生物生物量，其具有分解有机质、为植物提供养分的功能，是生态系统健康的指示物[45]。土壤真菌的多样性决定了生态系统的多样性和植物生产力[46]。长期添加秸秆能够提高和丰富土壤真菌群落，从而改善土壤特性[40]。李鹏等[22]发现水稻秸秆还田270 d和360 d后显著增加了土壤真菌的群体数量和多样性指数，即添加秸秆能够增加真菌群落的丰富度和多样性[11,32]。也有研究认为添加秸秆降低了真菌和细菌的OTUs丰富度和多样性[24]。本研究也得到了相同的结论即添加秸秆后降低了土壤中真菌的OTU数和Alpha多样性。微生物群落的丰度和多样性很大程度上取决于土壤的pH值和营养状况[47-48]，通常pH值升高抑制微生物生长，导致其群落多样性下降[49]。本试验所用的土壤为苏打盐碱土，添加秸秆后pH值高达8.64，对真菌生长产生了抑制作用。另一方面可能水稻秸秆的C/N比较大，添加到土壤后导致土壤中的C/N升高，土壤中没有足够的氮素提供真菌活动，从而降低了土壤真菌的多样性。

3.4 秸秆连续还田对土壤真菌群落结构的影响

土壤微生物群落的多样性和结构对环境变化特别敏感，所以能够很好地反映土壤质量变化[11]。秸秆还田增加了土壤外源有机碳源，对真菌群落有很大的影响[50]。李鹏等[22]研究指出土壤有机碳、pH值和速效磷是引起土壤真菌群落结构及多样性变异的主要因素。前人关于秸秆还田的短期培养试验和长期的大田试验均发现添加秸秆能够改变真菌的群落结构[23-24]。本研究的PCoA分析表明添加秸秆处理与对照明显区分开，说明秸秆添加改变了土壤真菌群落结构，其中高秸秆还田量对其影响更为显著。本研究通过RDA和Mantel 检验分析表明，全磷、有效磷、全钾、速效钾以及有机质含量与真菌群落结构差异达到了显著和极显著水平。土壤微生物对外界条件十分敏感，如土壤类型、土壤pH值、温度和湿度、作物根系分泌物等[19]。本试验中秸秆还田改变了土壤中的有机质和氮磷钾含量，所以推测秸秆还田后土壤理化性质发生改变，进而影响微生物群落结构与多样性。

4 结 论

1)秸秆还田明显提高了土壤有机质、磷、钾含量，从而改善土壤的养分状况，16.5 t·hm-2(RS4)处理改良效果尤为显著；

2) 秸秆还田显著提高了部分土壤真菌门和菌属的相对丰度，其中3.0 t·hm-2(RS1)和16.5 t·hm-2(RS4)处理提高效果尤为显著；

3)秸秆还田降低了真菌Alpha 多样性，改变了真菌的群落结构，全磷、有效磷、全钾、速效钾以及有机质含量是影响土壤微生物群落结构差异的重要环境因子。表明秸秆还田能够调节土壤的理化性质，从而影响真菌的群落结构。