冠状动脉旁路移植术后心房颤动患者ceRNA机制的研究▲

雷 登 贺阳晨 郑宝石 冯 旭

(广西医科大学第一附属医院，广西南宁市 530021)

冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，CABG)是一种广泛开展的外科手术，而患者出现术后心房颤动(postoperative atrial fibrillation，POAF)是CABG术后常见的并发症，其发生率为20%～50%[1]。POAF的发病受多种因素影响[1-2]。有研究[3]发现，POAF和原发性非手术性心房颤动(以下简称房颤)共享遗传标记，如4q25位点的变异。随访研究也发现，POAF患者长期房颤的发生率往往更高[4-5]，提示POAF与原发性房颤密切相关。目前对POAF的诊断主要基于动态心电图，这具有明显的滞后性。POAF是许多不良结果的独立预测因子，与患者死亡率和经济负担加重显著相关[6-9]，识别POAF的高危人群具有重要意义。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种具有环状结构的非编码RNA，为癌症、精神障碍、免疫、心血管病等疾病的重要调控因子[10-12]。circRNA可作为竞争性内源性RNA，充当miRNA海绵发挥作用，以阻止miRNA与靶mRNA结合，上调靶基因表达水平[13]。本研究通过生物信息学方法对miRNA及其靶mRNA进行预测，构建circRNA-miRNA-hub基因网络，探讨 circRNA在POAF患者circRNA-miRNA-mRNA调控网络中的机制，为circRNA在POAF中的作用提供新的信息，并有助于探讨POAF的潜在发病机制。

1 材料和方法

1.1 材料 本研究中的circRNA芯片数据，我们从基因表达综合数据库(gene expression omnibus， GEO)中获取了数据集GSE97455，注释平台为GPL21825(074301 Arraystar Human CircRNA microarray V2)。使用GEO2R软件进行基因差异表达分析，得到GSE97455数据集中差异表达的circRNAs(differential expression of the circRNAs，DECs)，调整后P值<0.05，|logfold-change (FC)|≥1。下载GSE97455的矩阵文件和平台文件，然后将相应的探针名转换为国际标准的circRNA名称。

1.2 方法 (1)circRNAs靶向miRNAs的预测：使用Circular RNA Interactome数据库[14]预测circRNAs的靶向miRNAs。(2)房颤相关的miRNAs：人类microRNA疾病数据库(Human microRNA Disease Database， HMDD)收集了经实验证实的与miRNAs相关的疾病，包含大约1 206个miRNA和893种疾病[15]。利用HMDD数据库搜索房颤相关的miRNA，然后利用Venny 2.1.0获得DECs的靶miRNAs与房颤相关的miRNAs的交集，交集中的miRNAs与POAF的相关性更大。(3)miRNA靶基因的预测：利用miRTarBase[16]、TargetScan[17]和miRDB[18]数据库来预测靶基因，将3个数据库中都包含的mRNA作为候选靶mRNA。(4)相关DECs RT-PCR检测：选取我院心胸外科2019年7月至2020年12月收治的30例CABG患者的术前血液样本进行RT-PCR检测相关DECs，其中术后发生房颤患者8例，未发生房颤患者22例。本研究经我院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。(5)关键因子的筛选鉴定和circRNA-miRNA-hub基因的构建：STRING 11.0[19]用于预测靶mRNAs之间的关联。构建蛋白-蛋白相互作用网络。使用Cytoscape插件“cytoHubba”鉴定关键基因，对排名前10位的节点进行下一步分析。利用Cytoscape 3.7.2构建circRNA-miRNA-hub基因网络。整个研究过程的平台流程见图1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据分析及绘图。以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 研究过程流程图

2 结 果

2.1 circRNAs的差异表达 整个研究过程的流程见图1。总共得到55个DECs，其中21个circRNAs表达上调，34个circRNAs表达下调。见表1。

表1 circRNAs的差异表达情况

续表1

2.2 circRNA和miRNA间的相互作用 利用Circular RNA Interactome数据库预测DECs相关的靶miRNA，得到716个miRNAs。结果表明DECs可以调控大量的靶miRNAs，其中3个DECs的靶miRNAs的频率最高，分别是hsa-miR-1184、hsa-miR-1205和hsa-miR-1236。

2.3 重叠的miRNAs及相关的DECs HMDD数据库中包含多种与疾病相关的miRNAs，并已经通过实验验证。我们在HMDD数据库中获得73个与房颤相关的miRNAs，再使用Venny 2.1.0得到其与靶miRNAs的交集(图2)，共有8个重叠miRNAs与13个DECs相关(表2)。

注：蓝色表示DECs预测靶miRNAs，黄色代表与房颤相关的miRNAs，两圆圈的交集代表重叠的miRNAs，右侧框中是重叠miRNAs的名称

表2 重叠的miRNAs及相关的DECs

2.4 相关DECs RT-PCR检测 通过 circBase 网站(http://www.circbase.org/)获取circRNAs序列，将序列头尾相接，使用 NCBI 网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)设计引物(表3)，扩增产物须包含环化位点，以ACTB为内参，计算30例CABG患者相关DECs的相对表达量，随后对数据进行标准化处理。结果显示，与非房颤患者组相比，房颤患者组相关DECs表达差异明显，并且结果与预测结果一致(图3)，符合预期。

表3 qRT-PCR引物序列

图3 相关circRNA RT-PCR检测

2.5 circRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建 在3个不同miRNA靶数据库中，有5个重叠的miRNAs(hsa-miR-142、hsa-miR-144、hsa-miR-183、hsa-miR-223和hsa-miR-574)具有相同的靶标mRNA。然后，我们得到了6个DECs、5个重叠miRNAs和204个靶mRNAs，再使用“cytoHubba”插件鉴定了前10个hub基因。基于6个circRNAs、5个miRNAs和10个hub基因构建了一个circRNA-miRNA-hub基因网络。利用Cytoscape对circRNA-miRNA-hub基因网络进行了可视化分析(图4)。

图4 circRNA-miRNA-hub基因网络

3 讨 论

CABG患者住院期间POAF的发生率为20%～50%，寻找具有预测价值的生物标记物可以使患者获得有益的心脏外科护理，并且能进一步开展个性化治疗策略，如预防性干预和加强监控等，可以最大限度地降低患者发生POAF的风险[20]。circRNA非常稳定，可以避免其外切酶和去分支酶的影响[21]。因此，circRNA在识别患者POAF风险方面具有独特的优势。研究[22]显示circRNA与多种疾病有关，如冠状动脉疾病、多发性硬化、类风湿关节炎、癌症等。一些学者也在CABG术后患者的血浆及血浆外泌体中发现了大量DECs，表明circRNA可能在POAF的发展中发挥重要作用[20-22]。

本研究中，我们用Circular RNA Interactome数据库预测circRNAs的靶miRNA，miRNA结合的DECs越多，越有可能参与POAF的发病机制，这些DECs的靶miRNAs中频率最高的3个miRNAs分别是hsa-miR-1184、hsa-miR-1205、hsa-miR-1236。以往的研究中，这3个miRNAs主要与癌症相关[23-25]，而本研究发现它们与POAF的关系。miRNAs是一类约有22个核苷酸的单链非编码RNA，在进化上高度保守[26]。miRNAs与癌症、糖尿病、心脏病和自身免疫性疾病等有关[27-28]。研究表明，miRNA-483-5p、miRNA-29a、miRNA-23a、miRNA-26a、miRNA-199a、miRNA-1和miRNA-133a等miRNAs被用作CABG患者POAF风险的潜在预测因子[20]。同时，这些miRNAs也被收集到HMDD数据库中作为房颤相关的miRNA。

根据以往研究，在随访中发现POAF患者更倾向于发生房颤[29]，提示POAF的发生与原发性房颤密切相关。因此，我们从HMDD数据库中选择73个房颤相关miRNAs，如果DECs与已报道的房颤相关miRNAs相互作用，则它们更有可能与POAF相关。本研究得到13个DECs与8个房颤相关的miRNAs作用，我们预测了这8个miRNAs的靶mRNA，在3个不同miRNA靶基因数据库中，只有5个miRNAs具有相同的靶基因。最后，我们获得了一个circRNA-miRNA-mRNA调控网络，其由6个DECs、5个重叠miRNAs和204个靶mRNAs组成。接着，我们构建了circRNA-miRNA-hub基因网络，使用“cytoHubba”插件识别出前10个hub基因(图4)，其中WASL、ECT2、ITGB1和EZR参与癌细胞的迁移和侵袭[29-32]，与癌症有关。据报道，TORTV相关的ACTN4/CAPN12单核苷酸多态性与冠状动脉疾病、心率和房颤有关[33]。RAC1已被证实可增强心房重构和心房纤维化，抑制RAC1活性有助于抑制房颤的进展[34-36]。有报道称RHOA-ROCK信号通路与人类心脏疾病密切相关，而ROCK抑制可导致不成熟的静脉窦心肌，包括窦房结和左侧静脉窦起搏器表型的异位维持[37]。Chen等[38]研究发现房颤患者的左心房细胞中ROCK1和ROCK2的表达明显高于正常人，并且ROCK2、ROCK1可能参与房颤患者的左心房细胞的肌溶解，进而导致心房扩大。Düzen等[39]研究发现房颤患者白细胞基因RHOC、RHOH、RAC3、RHOB、ROCK1、ROCK2表达明显升高，提示白细胞RHO/ROCK基因表达可能通过激活免疫或炎症级联反应参与非瓣膜性房颤的发病机制。

对于6个DECs，目前还没有研究报道其与POAF有关。Slagsvold等[40]利用心脏手术后房颤患者和正常心律患者的心耳组织来探索线粒体功能和miRNA之间的关系,发现房颤患者中miR-144的表达显著上调，房颤患者心耳组织的最大线粒体呼吸率均增加。这提示线粒体功能和miRNA，包括miR-144和miR-486都参与了房颤的病理生理过程。王坚刚等[41]利用微阵列芯片和RT-PCR法来鉴定房颤相关的miRNA表达谱及其靶基因，发现房颤患者中miR-142、miR-223、miR-146b和miR-486明显过表达，其中miR-142和miR-486的表达上调超过2倍。Liu等[42]用同样的方法来分析二尖瓣置换术患者的左心耳组织miRNA的表达水平,发现miR-574在窦性节律者和房颤患者之间表达量差异显著，miR-574可能参与了与房颤相关的几个重要功能通路(如mTOR、Wnt和Notch信号通路)，为房颤的分子机制提供了新的线索，并揭示了心脏手术患者房颤相关miRNAs的表达与POAF进展之间的潜在联系。因此，我们推测DECs通过吸附miRNAs，进而调控与房颤进展相关的靶基因的表达，从而在POAF中发挥作用。我们的研究结果为POAF发病机制提供了新思路，并值得更深入的探索。

综上所述，POAF发生的机制可能与circRNA和miRNA的失调密切相关，circRNA-miRNA-mRNA网络特异性参与调控多种通路和细胞分子生物学过程。在本研究中，我们发现了可能用于预测POAF的血浆circRNA生物标志物，为POAF的发病机制提供了新的线索，对POAF患者的诊断、治疗和预后有一定的指导意义。