应用流式细胞术对柳属染色体倍性与基因组大小测定1)

任伟超 徐姣 樊锐锋 刘美琦 于欣欣 王思嘉 马伟

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

流式细胞术(FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术[1]。目前已广泛应用于植物的遗传学、发育学及基因组大小测定的研究中。已经在广金钱草[2]、苔藓[3]、兰属[4]、黄芩[5]、紫草[6]等植物基因组大小测定中有所应用。

柳属植物染色体倍性差异较大，包括二倍体、四倍体、六倍体，甚至十二倍体等，其中灌木类以二倍体为主，乔木类多为异源多倍体[7-9]。刘丽[10]以二倍体杞柳为对照，测定红叶腺柳为二倍体，金丝垂柳、垂爆柳、旱柳、圆头柳、漳河柳、黑柳、垂109为四倍体，竹柳、苏柳J799为六倍体。张健等[11]测定旱柳的3个品种(沿江柳、9901柳、海柳1号)均为四倍体，同时应用流式细胞仪推测旱柳的基因组大小为670 Mb左右。有关柳属倍性研究、DNA占染色体数量比例测定、染色体核型分析等细胞遗传学的研究较少。

本研究以6种柳属植物的圆头柳(Salixcapitata)、乌柳(Salixcheilophila)、五蕊柳(Salixpentandra)、三蕊柳(Salixtriandra)、垂柳(Salixtriandra)、杞柳(Salixintegra)为研究对象，选取大豆(Glycinemax)、黄瓜(Cucumissativus)作为标准品；应用流式细胞术，采用单细胞液测量、混合细胞液测量2种测量方法对部分柳属植物染色体倍性测定和基因组大小进行评估，分析不同种柳属或同一种不同倍性的柳属与其基因组大小之间的关联性。旨在为柳属细胞标记鉴定、从分子水平为柳属植物的分类及柳属全基因组测序提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料取自哈尔滨市柳属的无性系水培苗。培养条件——温度25 ℃，光照期12 h，暗期12 h，光照度3 300 lx，培养20 d；取材部位为选取无病虫害且生长特性好的新鲜嫩叶，用于染色体倍性测试和基因组大小测试(见表1)。

1.2 染色体倍性测试及基因组大小测试方法

标准品的准备：要求待测样基因的大小，在标准品基因组大小范围内为原则。目前已知柳属植物的基因大小范围342～841 Mb，按照要求，为了保证测试效果，本研究选取大豆(基因1 150 Mb)、黄瓜(基因350 Mb)作为标准品。

单细胞悬液的制备：分别取1 g柳属待测样新鲜叶片，放入2 mL细胞裂解液中，用锋利的刀片将其切碎，经0.7 mm的滤膜过滤后试管收集滤液，放入离心机在1 000 r/min速度下离心5 min，弃掉上清液，收集沉淀细胞核。

表1 用于染色体倍性测试和基因组大小测试的材料

混合液制备：先用碘化丙啶染液对细胞核重悬，将细胞核悬液DNA进行荧光标记，温度4 ℃下暗处染色20 min，再将2种以上的染液混合在一起，形成混合液。用流式细胞仪对待测样品进行基因组大小鉴定。

样品上机检测：调整参数，将标准品的横坐标固定。通过单独上样检测，估算两个标准品的粒子数，并检查样品质量；按比例与待测样混匀后进行检测，根据出现峰的横坐标的位置，并结合大豆和黄瓜的基因组大小，通过公式计算，判断待测样柳属各品种的基因组大小。

1.3 数据处理

根据标准品杞柳和待测样的图中峰值的相对位置，确定待测柳属的染色体倍性，用公式计算染色体倍性水平，待测柳属倍性水平=标准品杞柳倍性水平(待测柳属G1峰荧光均值/柳属标准品G1峰荧光均值)。CellQuest软件(美国BD公司)数据下载，ModFit软件(Yerity Software House公司)处理图像。

2 结果与分析

2.1 染色体倍性鉴定

利用流式细胞仪测定杞柳DNA占染色体数量比例时，将出现最高峰G1设定在横坐标数值为45附近处，以杞柳DNA占染色体数量比例的荧光强度(横坐标)为对照，计算二者倍性系数，进而得到待测样品的染色体倍性。杞柳在横坐标45.51处出现1个主峰(见图1)。

二倍体柳属品种：流式细胞仪测定，乌柳均在横坐标46处左右出现了主峰，乌柳的G1峰位置在横坐标45.26处，倍数关系为0.99，表明乌柳的倍性约为杞柳倍性的1倍，即乌柳为二倍体，染色体倍性测试出峰位置(见图2)。

图1 流式细胞仪测定的杞柳标准品

图2 流式细胞仪测定的乌柳染色体倍性

四倍体柳属品种：流式细胞仪测定，圆头柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳在横坐标90左右出现了主峰，与标准品二倍体杞柳出现主峰的位置(45.51)比较，做倍性分析。圆头柳的G1峰位置在95.63，倍数关系为2.10；五蕊柳的G1峰位置在横坐标84.34处，倍数关系为1.85；三蕊柳的G1峰位置在横坐标89.15处，倍数关系为1.96；垂柳的G1峰位置在横坐标83.71处，倍数关系为1.84。说明4种柳的倍性约为杞柳染色体倍性(二倍体)的2倍，即圆头柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳均为四倍体，它们在染色体倍性测试中出峰的位置见图3。

2.2 柳属基因组大小预测

以黄瓜(基因350 Mb)、大豆(基因1 150 Mb)为对照品，首先测试黄瓜细胞的单细胞悬液，设置DNA占染色体数量比例定为横坐标50处左右，以此为对照，测定大豆的DNA占染色体数量比例。测定结果：黄瓜的G1峰位置在横坐标50.95处(如图4A)，大豆的G1峰位置在横坐标170.23处(如图4B)。

图3 流式细胞仪测定的四倍体柳属植物

图4 流式细胞仪测定黄瓜、大豆DNA占染色体数量比例

圆头柳基因组大小：圆头柳的G1峰位置在横坐标95.63处(见图5A)。分别以黄瓜、大豆为标准品，圆头柳基因组大小分别为656.93、646.03 Mb。此种方法获得圆头柳基因组大小范围为646.03～656.93 Mb。对圆头柳、黄瓜、大豆3者的混合样进行测定(见图5B)。以黄瓜、大豆为标准品，圆头柳基因组大小为659.57、628.22 Mb。结合以上2种方法，测得圆头柳基因组大小范围628.22～659.57 Mb。本研究预测，二倍体圆头柳的基因组大小约为640 Mb。

乌柳基因组大小：乌柳的G1峰位置在横坐标45.26处(见图6A)。分别以黄瓜、大豆为标准品，乌柳基因组大小分别为310.91、305.76 Mb；此种方法获得乌柳基因组大小范围为305.76～310.91 Mb。试验结果表明，乌柳基因组大小与黄瓜较近，因此，只用大豆与乌柳的混合样品测试(见图6B)。以大豆为标准品，乌柳基因组大小为290.69 Mb。结合以上2种方法测得，乌柳基因组大小范围290.69～310.91 Mb。本研究预测，二倍体乌柳的基因组大小约为300 Mb。

五蕊柳基因组大小：五蕊柳的G1峰位置在横坐标84.34处(见图7A)。分别以黄瓜、大豆为标准品，五蕊柳基因组大小分别为579.37、569.76 Mb；此方法获得五蕊柳的基因组大小范围为569.76～579.37 Mb。五蕊柳、黄瓜、大豆3者混合样进行测定(见图7B)。以黄瓜和大豆为标准品，五蕊柳基因组大小为612.54、571.18 Mb；结合以上2种方法测得，五蕊柳基因组大小范围569.76～612.54 Mb。本研究预测，四倍体五蕊柳的基因组大小约为580 Mb。

图5 流式细胞仪预测圆头柳基因组大小

图6 流式细胞仪预测乌柳基因组大小

图7 流式细胞仪预测五蕊柳基因组大小

三蕊柳基因组大小：三蕊柳的G1峰位置在横坐标89.15处(见图8A)。分别以黄瓜、大豆为标准品，三蕊柳基因组大小分别为612.41、602.25 Mb；三蕊柳的基因组大小范围为602.25～612.41 Mb。三蕊柳、黄瓜、大豆3者混合样(见图8B)。以黄瓜、大豆为标准品，三蕊柳基因组大小为665.91、556.58 Mb。结合以上2种方法测得，三蕊柳基因组大小范围556.58～665.91 Mb。本研究预测，四倍体三蕊柳的基因组大小约为610 Mb。

垂柳基因组大小：垂柳的G1峰位置在横坐标83.71处(见图9A)。分别以黄瓜、大豆为标准品，垂柳基因组大小为575.04、565.51 Mb；此方法获得垂柳基因组大小范围为565.51～575.04 Mb。垂柳、黄瓜、大豆3者混合样进行测定(见图9B)。以黄瓜、大豆为标准品，垂柳基因组大小为629.09、566.89 Mb。结合以上2种方法测得，垂柳基因组大小范围565.51～629.09 Mb。四倍体垂柳的基因组大小约为580 Mb。

图8 流式细胞仪预测三蕊柳基因组大小

图9 流式细胞仪预测垂柳基因组大小

杞柳基因组大小：杞柳的G1峰位置在横坐标45.51处(见图10A)。以黄瓜、大豆为标准品，杞柳基因组大小为312.63、307.45 Mb；此方法获得杞柳基因组大小范围为307.45～312.63 Mb。用流式细胞仪对杞柳、大豆混合样进行测定，杞柳基因组大小为285.51 Mb。结合以上2种方法测得，杞柳基因组大小范围为285.51～312.63 Mb。因此，二倍体杞柳的基因组大小约为300 Mb。

图10 流式细胞仪预测杞柳基因组大小

3 结论与讨论

柳属植物种质资源丰富，针对柳属植物的物种鉴定也从传统的形态学鉴定逐步发展到依据叶片图像数字化信息的识别[12]。柳属植物具有作为我国重要的绿化及造林树种被广泛应用，也具有极高的药用价值[13]。柳属植物具有生长迅速、更新快的特点，可以吸收土壤中的污染物，进而降低土壤污染[14-17]。柳属的倍性研究，对柳属全基因组测序有着重要意义。本研究利用流式细胞术对柳属无性系的倍性进行检测，以已知二倍体杞柳为对照，测定6种柳属植物无性系水培苗，依据与杞柳二倍体的倍数关系，确定待测样品的倍性。对6种柳属进行总DNA占染色体数量比例的测试，标准品为黄瓜(基因350 Mb)[18]、大豆(基因1 150 Mb)[19]，采用2种方式进行测定(单细胞液测量和混合细胞液测量)，获得不同基因组大小的数值范围。

乌柳为二倍体；圆头柳、五蕊柳、三蕊柳、垂柳为四倍体；结合柳属形态学，乌柳叶片面积最小，而四倍体的4种柳的叶片面积相对较大。推断，随着倍性的增加，柳属植物叶片面积增大。该结论验证了“多倍体植物中的营养体较大，表现如叶大株高”的说法。研究结果显示6种柳属基因组大小，乌柳(290.69～310.91 Mb)预测值为300 Mb、圆头柳(628.22～656.93 Mb)预测值为640 Mb、五蕊柳(569.76～612.54 Mb)预测值为580 Mb、三蕊柳(569.76～612.41 Mb)预测值为610 Mb、垂柳(565.51～629.09 Mb)预测值为580 Mb、杞柳(285.51～312.63 Mb)预测值为300 Mb。二倍体的乌柳、杞柳基因组大小数值最小，约为300 Mb；四倍体的圆头柳基因组大小数值最大，约为640 Mb；因此6种柳属基因组大小为285～640 Mb之间。除了乌柳、杞柳以外，均在目前已知柳属植物基因组大小的342～841 Mb之间。