转betA基因小黑杨生长及适应性1)

葛梦妍 顾宸瑞 陈坤 王伟 王楚 刘桂丰

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

汪广宇 姜静

(黑龙江嘉懋园林建设股份有限公司) (林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学))

高等植物在受到渗透胁迫后，其体内的甜菜碱醛脱氢酶活性升高，并在细胞质中积累甜菜碱，进而提高了植物对干旱及盐胁迫的适应性[1-4]。植物的甜菜碱是以胆碱为底物合成，经胆碱加单氧酶(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)两步催化完成[5-6]。而来自大肠杆菌的betA基因编码的胆碱脱氢酶(CDH)具有胆碱加单氧酶(CMO)与甜菜碱醛脱氢酶(BADH)两个酶的功能，能够催化甜菜碱合成的两个连续反应，既能以胆碱为底物，也能以甜菜碱醛为底物进行甜菜碱的合成[7]。因此，编码胆碱脱氢酶基因(betA)被认为是植物耐盐基因工程中的有效基因，已经广泛用于植物的耐盐转基因研究[8-17]。笔者所在的团队以东北地区广泛推广的小黑杨(Populussimonii×P.nigra)为转基因受体，开展胆碱脱氢酶基因(betA)的转化研究。获得的转betA基因小黑杨，苗期NaCl胁迫试验显示，转基因株系的甜菜碱含量均显著高于对照株系，根据NaCl胁迫后苗木的抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、盐害指数等指标,选出TB1、TB2、T4、T5、T6株系为耐盐优良株系[18-21]。在轻度盐碱地营建4 a的转betA小黑杨试验林分析显示，T01株系其树高、胸径和材积生长表现最好，分别较对照株系高14.74%、18.81%和47.50%，根据隶属函数值选出T1、T6和T8转基因株系为耐盐优良株系[22]。由于林木具有生长周期长、受自然因素影响大、可控制性差的特点，部分性状表现早、晚期相关性弱，对转基因小黑杨耐盐性的早期评价尚需进一步验证，为此，试验针对13年生的转基因小黑杨林分再次进行调查，检测目标基因的稳定性，评价转基因株系的生长适应性，研究结果为环境释放及生产性试验提供指导。

1 试验地概况

试验点设置在黑龙江省大庆市林原镇新华六队，属于半干旱碳酸盐碱地的代表。年平均气温4.2 ℃，极端最低气温-39.2 ℃，最热月平均气温23.3 ℃，极端最高气温39.8 ℃，年均无霜期143 d。年均降水量427.5 mm，年均蒸发量1 635 mm。土壤pH=10.8，有机质质量分数1.98%。

2 材料与方法

试验材料为小黑杨转betA基因株系。2004年春，将小黑杨转基因(betA)株系与对照株系1年生扦插苗去掉地上部分，仅用苗根在大庆进行定植试验。试验林均按照完全随机区组设计，4次重复。参试株系14个，其中转基因株系13个(分别命名为T01、T02、T04、T05、T06、T07、T08、T09、T10、T11、T12、T13、T14)，对照株系(CK)1个，采用8株小区4行排列，株行距2 m×3 m，试验地周围设置3行保护行。造林后按照常规林分管理，包括定杆、除草、松土、病虫害防治等。

2.1 目标基因的分子检测

PCR检测引物序列：根据betA序列，用DNASTAR的Primer Select软件，设计引物betA-F：5′-TACATCATTATTGGTGCCGGCTCA-3′；betA-R：5′-CATCCCATTTGCCACAAAATATCCC-3′。

PCR扩增检测：采用植物总DNA提取试剂盒提取参试株系叶片总DNA，以betA载体质粒DNA为阳性对照，以水为阴性对照，用上述引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系为：在25 μL反应体积中含DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，1.1×T3 Super PCR Mix 12.5 μL，加ddH2O补齐至25 μL。PCR扩增程序为：96 ℃预变性3 min；进行PCR循环；96 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，34个循环后继续于72 ℃延伸5 min，16 ℃保温。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶检测。

RT-PCR扩增检测：采用离心柱型总RNA快速提取试剂盒提取参试株系叶片总RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix试剂盒反转录为cDNA，将cDNA稀释10倍后用于RT-PCR模板。RT-PCR引物、反应体系及程序同上，PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶检测。

2.2 试验林性状调查及数据分析

2017年秋，调查了小黑杨转基因株系试验林的所有单株，采用超声波测高测距仪测量了树高，精确至0.1 m；采用胸径尺测量了胸径，精确至0.1 cm；依据各试验点内的保存株数计算各株系保存率；根据小黑杨的二元材积表[23]计算单株材积:

V=0.000 730 584 099-0.000 040 168 020 5D2+

0.000 034 384 964 4D2H+0.000 337 503 207H+

0.000 002 052 761 11DH2。

式中：V为小黑杨的材积(m3)；D为测得的小黑杨胸径值(cm)；H为测得的小黑杨树高值(m)。

经过13 a的造林试验，试验点中保留株系共计11个，包括10个转基因株系(T01、T02、T04、T05、T06、T08、T09、T12、T13、T14)和1个对照株系(CK)，但由于T02、T04、T09、T14保存率较低，未纳入统计分析，树高、胸径、材积及保存率仅统计分析了7个株系，即T01、T05、T06、T08、T12、T13和CK株系。

数据分析方法：利用SPSS19.0软件对树高、胸径、材积和保存率4个性状进行方差分析及多重比较，并通过隶属函数法选择出在试验点适应性较好的株系。

式中：u(Xi)为第i个性状的隶属函数值，Xi为第i个性状的数值，Xmin为第i个性状的最小值，Xmax为第i个性状的最大值。

计算材积和保存率2个性状的隶属函数值并给予权重，用加权单因子法计算出各株系的隶属函数均值。

重复力计算公式：

式中:F为方差分析中株系间F值。

遗传增益计算公式：

变异系数计算公式：

式中:σ为标准差;μ为平均值。

3 结果与分析

3.1 betA基因在小黑杨基因组中整合和表达

以待测株系叶片总DNA为模板，以betA质粒为阳性对照，以水为阴性对照，对外源betA基因进行PCR扩增，结果如图1A，转基因株系均在1 500 bp呈现特异性扩增条带，与预期的betA基因序列(1 470 bp)大小吻合，而对照株系及水对照未见扩增谱带，说明13年生时，外源betA基因仍稳定整合于转基因株系基因组中，尚未发生丢失。

以上述株系的cDNA为模板，以betA质粒为阳性对照，进行RT-PCR检测，结果如图1B，转基因小黑杨在1 500 bp处均呈现特异性扩增谱带，与预期的betA基因序列(1 470 bp)大小吻合，而阴性对照均未见扩增谱带，说明转基因小黑杨中导入的外源betA基因能够在mRNA水平上正常表达。

1.Marker；2.阳性质粒;3.阴性水对照;4.对照株系;5～14.转betA株系T01、T02、T04、T05、T06、T08、T09、T12、T13、T14。

3.2 转基因株系生长性状差异显著性

在盐碱地开展造林试验的转基因株系，生长量及保存率是评定参试株系抗逆性的重要指标。因此，对参试的7个株系生长性状及保存率方差分析显示(表1)，株系间各生长性状及保存率的差异均达到了极显著水平(P<0.01)；株系间材积和保存率的变异系数均较大，分别为36.61%和28.20%，进一步对各性状方差分量分析发现，株系间树高、胸径、材积及保存率的方差分量比例分别为43.42%、76.00%、63.12%和35.69%，说明株系间的差异对各株系的生长表现有较大影响。基于上述转基因株系间的生长性状存在显著性差异，开展优良株系选择很有必要。

3.3 优良株系的选择

材积可以代表树木的生长量，因此试验利用材积、保存率2个性状采用模糊数学隶属函数法对7个株系进行综合评价(表2)，综合评价中对材积、保存率分别给予0.5的权重值，求算出隶属函数均值。隶属函数均值越高，其综合评价越好，若将隶属函数均值在0.8以上的评为优良株系，则入选株系为T01、T06和T08，其中T01名列前茅，为最优株系，树高、胸径、材积均值分别为11.03 m、11.76 cm、0.055 m3，遗传增益分别为12.1%、11.2%和34.5%；入选的T06、T08株系材积均值分别高于最差株系(T05)的228.64%、286.13%，材积遗传增益分别为5.8%、22.8%。本次入选的株系与2008年对5年生的该试验林优良株系选择结果一致(表2)，在2008年的选择分析中生长表现最差的T04、T07、T10、T11、T14等5个转基因株系，本次调查发现上述5个株系保存率已经降至10%以下，故此未纳入本次统计分析。由表2还可见，经过13 a的造林对比试验，入选的T01、T06、T08优良株系的保存率几乎没有发生变化，说明转betA小黑杨5年生时的选择结果准确可靠，外源betA基因在小黑杨基因组适宜位点的插入确实可以显著提高其耐盐性。

表1 参试株系各性状方差分析

表2 两次调查参试株系各性状平均值比较

株系2017年树高/m胸径/cm材积/m3保存率/%隶属函数均值排序CK(9.48±1.5)B(10.25±1.2494)B(0.037±0.013)C(82.6±5.7)AB0.704T01(11.03±1.4)A(11.76±0.96)A(0.055±0.014)A(81.3±16.1)AB0.901T05(7.27±1.6)C(6.08±1.70)C(0.013±0.008)D(41.7±19.1)B0.007T06(9.50±1.5)B(11.06±1.36)AB(0.043±0.016)B(90.6±6.3)A0.852T08(10.32±1.0)AB(11.6±1.00)A(0.050±0.011)AB(81.3±7.2)AB0.843T12(9.73±1.9)B(11.1±1.06)AB(0.044±0.015)B(59.4±12.0)B0.545T13(9.68±2.0)B(10.6±1.13)B(0.040±0.015)BC(60.9±26.2)B0.526

4 结论与讨论

4.1 外源betA基因在转基因小黑杨中的稳定表达

快速发展的生物技术下转基因作物新品种的不断培育为全球粮食安全保障带来了新的机遇,同时，转基因作物的环境释放和商品化生产也引起了全世界对转基因作物生物安全问题的极大关注[24]。1983年世界首例转基因植物培育成功，为植物基因工程带来了广阔前景，但转基因植物的应用也越来越受到争议。目前对由转基因逃逸可能导致的生态安全性等方面问题还没有结论性的结果，但已引起政府、社会和科学界的广泛关注[25]。笔者所在研究团队也对转基因小黑杨进行了生物安全性评价，采集了转基因株系根际土壤及周边杂草，分别对提取的DNA样品进行选择剂及目标基因的PCR检测，结果表明，目标基因既没有逃逸也没有释放到环境中，而是稳定存在于转基因小黑杨的基因组中。

本研究通过对转betA小黑杨的分子检测表明，betA基因在转基因株系的基因组中能够长期稳定整合并能够正常表达。13年生的转基因小黑杨株系均已到达可以用材的树龄，本研究的跟踪调查周期足够长，选择结果更加准确可靠。

4.2 转betA基因能够提高植物的耐盐性

积累渗透保护物质是植物在渗透胁迫条件下一种重要而普遍的适应机制,对于禾本科和藜科植物,最有效的物质当属季胺类化合物中的甘氨酸甜菜碱。它作为渗透保护物质一方面能够使细胞保持适当的渗透势而防止脱水；另一方面能够对生物大分子的结构及功能起稳定、保护作用。但烟草(NicotianatabacumL.)、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、马铃薯(SolanumtuberosumL.)、水稻(OryzasativaL.)等作物却没有合成甘氨酸甜菜碱的能力[8]。

早期研究表明，将betA基因转入烟草中并将转基因株系置于高浓度氯化钠溶液中培养，转基因烟草生长速度更快且能够积累甜菜碱，耐盐性有显著提升[26-27]；将betA基因转入番茄中，在200 mmol/L的NaCl处理下，转基因番茄与对照番茄相比叶片质膜透性降低23%，耐盐性增加[8];将betA基因转入棉花(Gossypiumspp.)中，在盐胁迫和低温胁迫下，转基因株系叶片中甘氨酸甜菜碱的含量均显著高于对照株系，且转基因棉花的种子萌发率较对照株系高近一倍，转基因棉花株系也表现出生物量增加，叶片失水慢的性状[28];将betA基因转入小麦(TriticumaestivumL.),经盐胁迫和干旱胁迫后，转基因小麦叶片中甘氨酸甜菜碱含量较对照株系高约2倍，在盐胁迫下的种子萌发率为对照株系的1.45倍，同时转基因小麦也表现出了生物量的增加和光合作用的改善，说明betA基因的转入显著提高了小麦的抗逆性[29-30]。2001年，笔者所在的林木遗传育种国家重点实验室首次将betA基因转入小黑杨中[31]，随后在小黑杨生长发育的不同阶段都进行了耐盐性试验并证实了betA基因确实能够提高小黑杨的耐盐性。本研究中，经过在盐碱地上的造林试验，面对长达13年的盐胁迫，转betA小黑杨株系依然表现出了良好的生长特性。

4.3 不同转基因株系间生长性状的差异

外源基因导入小黑杨基因组时，有时会对固有基因的转录表达产生影响，进而影响了转基因株系的生长发育，这是造成不同转基因株系间性状差异的主要因素，农杆菌介导的T-DNA插入不仅破坏了插入位点的基因功能，而且因为T-DNA序列已知，使得被破坏的基因序列的分离相对简单和快捷，因此该技术被广泛地用于功能基因的研究[32]。在本研究中，最初在造林地点对12个小黑杨株系进行了造林对比试验，经过4 a造林试验后，虽然全部存活，但几个耐盐性差的转基因株系(T04、T07、T10、T11、T14)的生长量和保存率明显小于其他优良耐盐株系和对照株系；13 a后，上述耐盐性差的5个转基因株系陆续死亡，说明外源基因的插入非但没有提高这些株系的抗盐碱能力，反而影响了该株系的正常生长发育。T01、T06和T08这3个株系在盐碱地具有生长快、保存率高的优良表现，说明外源基因在这3个株系株系的基因组中插入到适宜的位点，既不影响转基因小黑杨的正常生长，又使植株获得了比较好的耐盐碱能力。

通过对两次优良株系的选择结果进行对比可以发现，2017年和2008年所选择出的优良株系一致，且两次调查中，各株系的生长表现排序完全相同。说明小黑杨作为速生树种，在造林试验的初期就可以获得准确可靠的选择结果。