基于非对称场流分离技术研究直链/支链比值对小米淀粉退化行为的影响

宋天歌， 张靖， 陈雪， 申世刚， 窦海洋

(1. 河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002；2. 河北大学 基础医学院，河北 保定 071000)

小米起源于中国黄河流域，不仅是世界上最早栽培农作物之一，还是中国主要的粮食作物之一.小米具有较高的营养价值，被用于生产食品和饮品.而这些产品的品质在很大程度上与其淀粉成分的性质和结构有关[1].

淀粉主要由直链淀粉(amylose, AM)和支链淀粉(amylopectin, AP)组成,其中，线性的AM分子是由α-(1→4)糖苷键连接而成的；AP分子的分支度高，分子质量大，构成淀粉颗粒的骨架[2].在分子结构上直链淀粉葡萄糖链上的氢键更广泛，葡萄糖分子排列较整齐，食用后不容易被消化，而支链淀粉与酶接触的表面积更大，更容易被分解[3].在淀粉中，AM和AP的比例对淀粉的结构、糊化温度、溶解性、黏度、水结合能力和退化行为有重要影响，进而影响小米产品品质.食物的稳定性、消化性等功能特性，储存过程中的口感和硬度以及传统淀粉类产品的保质期都与淀粉退化密切相关[4].退化的淀粉被用于功能食品的开发，例如降低糖尿病和心血管疾病患病风险可以通过食用退化淀粉食品来实现[5].目前，双波长分光光度法和近红外光谱法用于测定淀粉中AM和AP，但由于需要构建标准曲线或精准模型，对于未知样品的检测有一定的局限性.因此，发展准确高效的AM和AP的分离检测技术具有重要意义.

在1987年由Wahlund和Giddings博士[6]提出了可用于分离表征大分子和纳米颗粒的非对称场流分离(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4)技术.该技术可成功分离表征蛋白质、蛋白质复合物、纳米级/微米级粒子、亚细胞单元和聚合物[7].AF4主要通过外加力场的作用，根据样品粒径大小的差异达到分离目的.AF4无固定相，降低了剪切力对支链淀粉降解的风险.AF4与示差折光检测器(differential refractive index,dRI)和多角度激光光散射检测器(multiangle light scattering,MALS)联用已应用于淀粉的分离表征[8].鲜有关于AF4-MALS-dRI研究m(AM)/m(AP)比值对淀粉退化行为的报道.本文采用碱性甘油超声法提取普通小米直链淀粉，改变其m(AM)/m(AP)的比值，通过AF4-MALS-dRI结合其他表征手段对3种不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的理化性质及其退化行为进行研究.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

普通小米和蜡质小米(农林科学院谷子研究所，河北省).NaOH、Na2HPO4、NaNO3、NaCl、NaH2PO4、NaN3(麦克林生化科技有限公司，上海)，C3H8O3、C2H5OH(科密欧化学试剂有限公司，天津)，HCl(北京化工厂，北京)，所用试剂均为AR级.

场流分离系统(Eclipse AF4)(Wyatt公司，德国)；多角度激光光散射检测器(DAWN HELEOS Ⅱ MALS)(Wyatt公司，美国)；示差折光检测器(Agilent 1260 Infinity ⅡdRI)；液相泵(Agilent 1260)(Agilent公司，德国)；电热鼓风干燥箱(DHG-914385-Ⅲ)(新苗医疗器械制造有限公司，上海)；超纯水系统(Milli-Q Advantage A 10)(Millipore公司，美国)；数控超声波清洗机(KQ5200DE)(昆山超声仪器有限公司，上海).

1.2 小米淀粉样品的制备

普通小米淀粉和蜡质小米淀粉根据张靖等[9]的方法进行提取.去除小米淀粉中的AM淀粉参考Setyawati等[10]的方法.称取2.0 g干燥且过100目(150 μm)筛的小米淀粉，加入到8.0 g质量分数75%混合的碱性甘油(1 mol/L NaOH)中，搅拌均匀，置于70 ℃水浴200 W超声1 h.搅拌1 h转速为200 r/min，4 615 r/min离心10 min，倒掉液体，除去上层杂质，将下层白色物质，水洗3次，除去多余的甘油和NaOH.用无水乙醇洗涤沉淀，在烘箱中40 ℃烘至恒重，最终得到由碱性甘油超声提取AM的小米淀粉.

碱性甘油超声提取小米直链淀粉的反应机理如图1所示.由于AM和AP结构不同[11]，AM是相对较长的线性分子，其螺旋结构具有疏水性，允许与有机分子形成疏水键，使AM容易从淀粉颗粒中游离出来.而AP的短支链较多，大部分不会与有机化合物形成足够长的螺旋状络合物.在天然AM中[10]，每取代1个羟基，就增加2个去质子化的甘油羟基，可以增强AM在水中的亲水性，而取代基的随机位置可以防止AM分子形成非极性外螺旋盘管，容易从水中沉淀出来.因此，用该方法可以去除淀粉颗粒中的AM.

图1 提取直链淀粉的反应机理[10]Fig.1 Reaction mechanism of extraction of amylose

1.3 小米淀粉的退化

将普通小米淀粉、蜡质小米淀粉和碱性甘油提取的小米淀粉按照张靖等[9]的方法进行溶解(2.0 g/L)，在4 ℃保存7 d进行AF4检测.将样品溶液放置室温，使用去离子水稀释至0.4 g/L，涡旋并静置5.0 min进行检测.

1.4 小米淀粉的表征

扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)：在5 kV的电压下，使用场发射扫描电子显微镜(Nova NanoSEM450美国)观察放大2 000倍后表面喷金的淀粉颗粒.

傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)：用于淀粉样品的结构分析.通过傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet iS10美国)，在4 000～400 cm-1将干燥过筛后的淀粉样品以4 cm-1的分辨率扫描16次.

X线衍射(X-ray diffraction,XRD)：分析样品的晶型.将不同AM/AP比值的小米淀粉均匀平铺于X线衍射光谱仪(D8 ADVANCE德国)试板中心，图谱2θ记录在40 kV和40 mA下5～35°扫描速率为1.5(°)/min，采样间隔为0.02°.

差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)：分析样品的热力学性质.通过差示扫描量热仪(DSC-60日本Shimadzu公司)测定样品.加热速率为10 ℃/min，加热25～200 ℃.在铝制坩埚中称取2.0 mg样品，加入去离子水6.0 μL，密封并室温放置2 h平衡，进行DSC测试，记录起始温度(To)、终止温度(Tc)、糊化焓(ΔH)、和峰值温度(Tp).

1.5 非对称场流分离技术

采用由聚碳酸酯上壳、不锈钢渗透熔块下板、截流量为10 ku的超滤膜、350 μm的聚酯梯形垫片组成的AF4通道对不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉样品进行检测，流动相为10 mmol/L NaNO3+3 mmol/L NaN3(pH=7.00)并用0.22 μm微孔滤膜过滤，使用0.1 μm YYLP 膜过滤器(Millipore, 德国)在液相泵和AF4系统间进行过滤，以确保进入系统样品无大颗粒干扰检测.以50 μL和0.4 g/L的体积和质量浓度进行检测，进样流速和检测器流速分别为0.2、1.0 mL/min，初始洗脱流速为1.2 mL/min，并以指数衰减降低到0.05 mL/min，历时14 min，t1/2=3.0 min.数据处理软件为ASTRA7.1.3，折光指数增量(dn/dc)为0.146 mL/g，以Berry模式[12]对实验数据进行拟合.

2 结果与讨论

2.1 小米淀粉颗粒的SEM表征

图2为3种不同AM/AP比值的小米淀粉颗粒的SEM图.由图2可知，3种不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的颗粒相貌相似，颗粒直径为3～15 μm，大小不一，表面具有凹陷，呈不规则多面体型结构，与文献中有关小米淀粉颗粒形貌的报道一致[1].利用超声和碱性甘油处理后的小米淀粉与普通小米淀粉的颗粒形貌无明显差异.

a.普通小米淀粉；b.蜡质小米淀粉；c.碱性甘油处理后小米淀粉.图2 小米淀粉的SEMFig.2 SEM images of millet starches

2.2 小米淀粉颗粒的FTIR表征

图3为3种小米淀粉的FTIR图谱.图3a中3 300 cm-1附近的红外吸收峰对应O—H的拉伸，表明氢键存在于分子内和分子间；2 925 cm-1处的红外吸收峰，与CH2的伸缩振动有关[13].图3b中由于淀粉无定形区域中存在少量水在1 641 cm-1处出现吸收峰[14]；由于脱水葡萄糖环的C—O键拉伸在1 076 cm-1和997 cm-1处有吸收峰的存在[15]；淀粉葡萄糖单元中吡喃糖环的骨架模式吸收峰产生在760 cm-1和708 cm-1处[16]；由C—O—H振动在1 335 cm-1处表现出吸收峰；α-1,4糖苷键的骨架(C—O—C)振动产生928 cm-1处的吸收峰[17]；—CH2结构对应859 cm-1处吸收峰[18].通过对比普通小米淀粉与碱性甘油处理的小米淀粉，其特征吸收峰的位置无明显变化，证明碱性甘油处理并没有引起官能团的改变.

图3 小米淀粉的FTIR图谱Fig.3 FTIR spectra of millet starches

图3中1 047 cm-1附近的特征吸收峰表示为淀粉颗粒中有序排列的结晶区.1 022 cm-1处的特征吸收峰表现为无定形非结晶区.定量反映淀粉颗粒中结晶区与非结晶区比例可用1 047 cm-1/1 022 cm-1处的比值表示.表1中R1047/1022为3种不同m(AM)/m(AP)比值的样品在1 047 cm-1处和1 022 cm-1处的比值.比值越大说明淀粉颗粒内部结晶区大，AP的含量多；蜡质小米的比值最大，质量分数75%碱性甘油处理的小米淀粉的R1047/1022值高于普通小米淀粉，说明碱性甘油处理去除了小米淀粉中部分AM.

2.3 小米淀粉颗粒的XRD表征

淀粉的结晶度与其物理性质相关.淀粉样品的结晶度与结晶区的占比呈正相关，且其强度、硬度和密度随结晶度的升高而增大，样品尺寸稳定性、耐热性和耐化学性也愈好.由3种不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的XRD数据(图4)得出3种小米淀粉是A型结构的淀粉[19]，分别在15°、17°、18°、23°处有明显的特征衍射峰.结果表明m(AM)/m(AP)的比值不影响淀粉的结晶类型.淀粉中结晶区占总体的比值即淀粉的相对结晶度.在XRD谱图中在结晶区(AP)呈现尖峰特征，非结晶区(AM)呈现弥散状态.使用软件Peakfit对整峰以及非结晶区面积进行拟合，得到整体峰的面积(A)和非结晶区面积(Aa)，则结晶区面积(Ac)=A-Aa，可知相对结晶度=100%×Ac/A.由表1可得相对结晶度从低到高依次为普通小米淀粉、75%碱性甘油处理的小米淀粉和蜡质小米淀粉.结果表明碱性甘油处理去除了部分AM与FTIR结果一致.

图4 小米淀粉的XRD图谱Fig.4 XRD patterns of millet starches

2.4 小米淀粉颗粒的DSC表征

不同直链/支链比例小米淀粉的糊化特性列于表1.结果显示普通小米淀粉的焓值低于蜡质小米淀粉，这是因为普通小米淀粉中直链淀粉的含量较高，蜡质小米淀粉更多的能量进行从有序状态到无序状态的相变过程[10].而质量分数75%碱性甘油处理后的普通小米淀粉结晶度较高，淀粉颗粒中因其弥散离子的作用从而形成分子间隙，致密的晶体区域更容易被水分子通过[20]从而使得ΔH的值却低于原样品.

表1 小米淀粉的表征

2.5 小米淀粉的AF4表征

图5是普通小米淀粉、蜡质小米淀粉和质量分数75%碱性甘油处理的小米淀粉的AF4-MALS-dRI分离谱图.图5a为AF4-dRI和Rg分布图.tr=3～5 min为AM洗脱峰，tr=12～15 min为AP洗脱峰.与普通小米淀粉相比，蜡质小米淀粉图谱中的tr=3～5 min处的AF4-dRI信号较弱，说明蜡质小米淀粉中AM含量很低.质量分数75%碱性甘油处理的小米淀粉的AF4-dRI信号比普通小米淀粉信号弱，说明质量分数75%碱性甘油提取了部分AM.从图5b可知，蜡质小米淀粉的AF4-MALS信号最低，而Mw和Rg无明显差异，表明m(AM)/m(AP)比值越小，淀粉分子结构越紧密.为了得到小米淀粉AM和AP的含量及比值使用Peakfit软件对图5a中AF4-dRI信号进行分峰拟合(表1).结果表明质量分数75%碱性甘油处理的小米淀粉的m(AM)/m(AP)的比值介于蜡质小米淀粉和普通小米淀粉的比值之间，说明碱性甘油可去除小米淀粉中部分的AM，与FTIR和XRD结果一致.

a.AFR-dRI分离图谱和回转半径分布;b.AF4-MALS和分子量分布.图5 不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉的AF4-MALS-dRI分离谱图、回转半径和分子量分布Fig.5 AF4-MALS-dRI fractograms，Rg and Mw distributions of millet starches with different m(AM)/m(AP) ratios

2.6 小米淀粉退化行为

图6是3种不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉在4 ℃储存7 d的AF4-MALS-dRI洗脱图谱.由图6a可知，普通小米淀粉AF4-dRI信号在tr=3～5 min时轻微降低，在tr=12～15 min处略微升高.由于有退化现象出现，随着储存时间的增加AF4-MALS信号明显增强[8].在tr=12～15 min时蜡质小米淀粉信号AF4-MALS和AF4-dRI信号无明显变化.短期退化[21]中通过氢键作用使AM形成了双螺旋结构，通过氢键的作用在其富集区内堆积生成结晶；而AP不易发生退化现象主要由于高度支化的分子结构，其外层支链间形成的双螺旋结构后需要经过较长时间发生重结晶.蜡质小米淀粉AM含量极低，因此没有短期退化的现象，碱性甘油处理后的小米淀粉退化现象与普通小米淀粉相比较微弱，由于碱性甘油处理后的小米淀粉的AM减少.

由表1可知，m(AM)/m(AP)比值最高的普通小米淀粉储存7 d后Mw增加最快，质量分数75%碱性甘油处理的小米淀粉的Mw变化趋势次之，蜡质小米淀粉的Mw变化趋势不明显.AM的快速重结晶和AP缓慢重结晶会造成的Mw的增加，实验结果表明m(AM)/m(AP)比值高的小米淀粉的退化程度高.

a、c、e.AF4-dRI分离图谱和回转半径分布;b、d、f.AF4-MALS和分子量分布.图6 不同m(AM)/m(AP)比值的小米淀粉4 ℃储存7 d的AF4-MALS-dRI分离谱Fig.6 AF4-MALS-dRI fractograms，Rg and Mw distributions of millet starches with different m(AM)/m(AP) ratios stored at 4 ℃ for 7 days

3 结论

本研究通过碱性甘油超声法改变小米淀粉中AM的含量.研究发现小米淀粉中m(AM)/m(AP)比值与其退化行为呈正相关.SEM扫描图显示3种不同比值的淀粉样品形貌无明显差异.FTIR结果表明碱性甘油处理没有引起官能团的改变.相对结晶度、结晶区与非结晶区的比值以及相变焓热都与m(AM)/m(AP)比值呈负相关，由于结构特征的影响质量分数75%碱性甘油处理的小米淀粉焓值最低.实验结果证明AF4-MALS-dRI是一种快速、高效可实现淀粉中不同m(AM)/m(AP)比值的检测方法，同时该方法可以用于监测淀粉的退化行为.