HPLC法测定睡安胶囊中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲及五味子甲素的含量

张晓娟，陈 凤

（玉林市食品药品检验检测中心，广西 玉林537000）

睡安胶囊由酸枣仁（炒）、五味子、远志、何首乌藤、丹参、石菖蒲、知母、茯苓、甘草等药材制成，具有养血安神、清心除烦的功效，对心烦不寐、怔忡惊悸、梦多易醒或久卧不眠有较好的疗效［1-2］。目前睡安胶囊质量标准中仅有鉴别项而无含量测定项目［3］，药品质量控制方法尚不够完善。据报道，由于五味子地理分布不同，其性状、化学成分的种类及含量存在着差异［4-6］。为保证药品疗效稳定，提高药品的质量标准，本文建立了HPLC法对睡安胶囊中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的含量进行测定，现报道如下。

1 实验材料

1.1 仪器LC-2030C 3D高效液相色谱仪DAD检测器（岛津仪器有限公司）；XS-205DU型电子分析天平（梅物勒-托利多仪器有限公司）；SB2200超声清洗器（上海必能信超声有限公司）；津腾过滤器（天津津腾实验室设备有限公司）。

1.2 试药 五味子醇甲对照品（批号：110857-201412，含量99.4%）、五味子酯甲对照品（批号：1529-200001，含量100%）、五味子甲素对照品（批号：110764-201714，含量99.3%）均购于中国食品药品检定研究院；五味子醇乙对照品（批号：PR160728-14，含量99.31%）购于Stanford Chemicals；睡安胶囊（批号：170613、191203、191118、200103，规格：每粒装0.5 g，广西玉林制药集团有限责任公司）；乙腈（色谱纯，Fisher Scientific）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，广东光华科技有限公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Scientific）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用依利特公司Supersil ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相以乙腈-0.01%磷酸（60∶40），流速为1.0 ml/min，检测波长为220 nm，柱温为30℃，进样量为20μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称定4种对照品至25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制备成浓度为五味子醇甲0.318 2 mg/ml、五味子醇乙0.448 9 mg/ml、五味子酯甲0.425 6 mg/ml、五味子甲素0.617 5 mg/ml的储备液；再精密量取五味子醇甲储备液2.5 ml、五味子醇乙储备液1.5 ml、五味子酯甲储备液0.5 ml、五味子甲素储备液0.5 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备［7-10］取睡安胶囊内容物2.0 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇20 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出放冷后，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，用滤纸过滤后再用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液的制备 按睡安胶囊制备工艺制成缺五味子的阴性样品，再按“2.2.2”项下操作制备阴性样品溶液。

2.2.4 系统适用性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各20μl，按2.1色谱条件下进行测定，记录色谱图。见图1。结果阴性溶液在与混合对照品溶液的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素相同保留时间上无色谱峰出现，说明阴性溶液对测定无干扰。

2.3 线性关系的考察 分别精密量取混合对照品溶液1μl、2μl、4μl、8μl、16μl、20μl，按2.1色谱条件进行分析，以对照品溶液浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 对照品的回归方程及线性范围

2.4 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素峰面积的RSD分别为0.51%、0.45%、0.39%、0.36%（均n=6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取批号为191203的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h进行测定，结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素峰面积的RSD分别为0.84%、0.26%、0.24%、1.15%（均n=6），表明供试品在48 h内稳定。

2.6 重复性试验 取供试品5份（批号：170613），按“2.2.2”项下法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件分别进样分析，测得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的平均含量分别为120.9μg/g、38.2μg/g、20.8μg/g、17.6μg/g，RSD分别为2.71%、1.34%、2.05%、3.39%（均n=5），表明重复性可满足分析要求。

2.7 加样回收率试验 精密称取样品（批号：170613）9份，分别加入混合对照品溶液低、中、高3个浓度，每个浓度3份，按“2.2.2”法制备供试品溶液，再按2.1色谱条件测定各成分的含量并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果 （n=9）

2.8 含量测定 取4批睡安胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。依“2.1”色谱条件测定，以外标法计算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果 （μg/g）

3 讨论

3.1 仪器的选择 预实验采用UPLC与HPLC同时摸索液相条件，通过比较发现，UPLC分析时间较快，但因超高压柱柱长和内径小，通过梯度洗脱等方法并未能改善供试品的分离度；而采用HPLC等梯度洗脱能较好实现供试品各特征峰的分离，故选用HPLC。

3.2 色谱柱的选择 先后使用Thermo Syncronis C18色谱柱、Agilent extend C18色谱柱、Agilent SB C18色谱柱及依利特Supersil ODS2等色谱柱，比较发现对于本实验依利特Supersil ODS2分离效果最好。

3.3 流动相的选择 比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同系统流动相，发现以乙腈-0.1%磷酸水溶液等梯度洗脱时峰形、分离度均最佳。

3.4 样品提取溶剂的选择 预实验对甲醇、75%甲醇、50%甲醇、无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水等溶剂进行提取效率考察，结果以75%甲醇提取供试品，目标物质测得量最高，且提出的色素等杂质也较少。

3.5 样品提取方法的选择 选定提取溶剂后，通过比较超声提取20 min、30 min、45 min，水浴回流提取30 min、45 min、60 min及索式提取等方法的提取效率，结果显示超声提取30 min为最优提取方法。

3.6 检测波长的选择 本实验采用DAD检测器在200～400 nm波长下进行全波长扫描，并采集光谱图，结果发现所测组分在220 nm有较好吸收，基线平整，无杂质峰干扰。

本实验建立HPLC法同时测定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素含量的方法，重现性好，回收率较高，精密度良好，为提高药品标准和更有效地控制药品质量提供了参考。